| 研究課題/領域番号 |
16K14582
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
松村 暢子 帝京大学, 医学部, 助教 (30317698)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | microRNA / ゲノム編集 / 骨髄間葉系幹細胞 / miR-96-5p / 神経細胞分化 |
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| 研究実績の概要 |
当研究室ではGTRAP3-18遺伝子の欠損が神経細胞のGSH産生に必要なシステイントランスポーター（EAAC1）の機能を亢進して神経保護的に働くこと、miR-96-5pがGTRAP3-18の発現上昇とEAAC1の発現抑制に働くこと見いだしてきた。本研究ではmiR-96遺伝子の欠損は神経細胞のGSH産生を亢進し、酸化ストレス抵抗性を促進すると考え、ゲノム編集によりmiR-96遺伝子を欠損した骨髄由来間葉系幹細胞（以下、骨髄幹細胞）を作成し、神経細胞へ分化させる方法を確立することを進めている。C57BL/6系統マウスの骨髄幹細胞の培養条件の確立や、神経分化誘導に必要なNICD遺伝子発現ベクターの作成に続き、H29年度は、培養骨髄幹細胞にマウス骨髄幹細胞のマーカータンパク質（CD29, CD90 および PDGFRβ）が発現することを確認し、多分化能の一つである脂肪細胞への分化が起こること、NICD遺伝子発現ベクターの導入により神経細胞様に分化すことを確認した。これに並行しCRIPR/Cas9ベクターにmiR-96遺伝子配列中にあるターゲット配列を挿入し、miR-96遺伝子に変異をもたらす4種のベクターを作成した。作成した全てのベクターにゲノム編集機能があることを、Single strand annealing assay (標的遺伝子配列を認識し、DNA二重鎖切断を生じさせる機能があることをEGFP発現で検出できる)により確認した。現在、骨髄幹細胞にCRISPR/Cas9 miR-96ベクターを導入し、miR-96を発現しない骨髄幹細胞の作成に着手している。ゲノムの変異を検出する方法としては遺伝子配列の確認と、RT microRNA PCR法による標的遺伝子産物の定量を行っているが、検出するにはベクターの導入効率を上げる必要性があることが分かり、効率を上げる手段を模索中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究の進行は加速している。昨年度の遅れを挽回しつつあるがまだ進行は遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
骨髄由来間葉系幹細胞にCRISPR/Cas9 miR-96ベクターを導入する方法として、トランスフェクションより導入効率と細胞生存率の高いエレクトロポレーション法を検討し、高確率でmiR-96遺伝子欠損細胞を作製する方法を確立する。その後は、C57BL/6系統のマウスから採取した骨髄幹細胞にmiR-96遺伝子を欠損させるゲノム編集を行う実験系に加え、既に作製維持しているGTRAP3-18遺伝子欠損マウスから骨髄由来幹細胞を採取し神経細胞へ分化させる実験系の２つの培養細胞系を用い、GTRAP3-18およびEAAC1遺伝子の発現量や細胞内GSH量の変化、過酸化水素による酸化ストレス下での生存能力について調べていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）研究の進行の遅れから、ゲノム編集の進行が当初の予定より遅れ、費用を使う作業内容が次年度に持ち越されたため次年度使用額が生じた。
（使用計画）遅れているゲノム編集実験の評価に必要な遺伝子シーケンシング費用に充てる予定である。
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