| 研究課題/領域番号 |
16K14590
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
深澤 太郎 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (10565774)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | アフリカツメガエル / 再生 / interleukin-11 |
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| 研究実績の概要 |
アフリカツメガエル幼生（オタマジャクシ）尾の再生は、切断した際に脊髄・脊索・筋を含む尾を再生するという高い再生能を示す。幼生尾再生は、各組織中に存在する組織幹細胞が尾の切断により各々活性化され、（細胞運命が拘束された）未分化細胞を生み出し、これらが分化して各々の組織を再形成する様式であるとされている。本研究は、尾再生時における各組織幹細胞の活性化もしくは活性化状態の維持に、組織の種類を問わない普遍的な機構があるとの作業仮説をたて、また当研究室で同定された尾再生時の再生芽（その後再生尾を形成する増殖細胞集団）の増殖細胞に選択的に発現しているinterleukin-11(il-11)がこの機構に関わると考え研究を行っている。当該年度では、(1)尾再生においてil-11が複数組織の未分化細胞の誘導・維持に必要十分であることを示した内容の論文をNature Communications誌にて発表した。幼生尾再生において複数種の未分化細胞の誘導・維持を単一の因子が担うことを示すもので、未分化細胞の誘導・維持の機構が各組織で共通であることを意味するものと考えている。この結果を受け、尾再生におけるIL-11シグナリングの作用点の解析を行った。まず、(2)尾切断時のIL-11シグナリングの下流に位置すると考えられる遺伝子群について、これらの再生過程での発現量変動が再生の進行とよく相関することを見出した。この遺伝子リストは未分化細胞の維持に関わる実働分子の探索に有用であると考えられる。また、(3)IL-11受容体α鎖をコードする遺伝子(il-11ra)をノックダウンしたところ、il-11ノックダウン時と同様の尾再生阻害が観察されたがよりシビアな表現型であった。今後のIL-11シグナリングの解析にil-11raノックダウンの系も有用であると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
アフリカツメガエル幼生尾再生において再生芽増殖細胞にて選択的に発現するil-11の再生への関与について解析を行った。当該年度では、(1)尾再生においてil-11が複数組織の未分化細胞の誘導・維持に必要十分であることを示した内容の論文をNature Commun.誌にて発表した。この結果を受け、尾再生におけるIL-11シグナリングの作用点の解析を行った。(2)我々の先行研究で、il-11ノックダウン個体と野生型個体とで尾切断後の発現遺伝子の比較により、尾再生時のIL-11シグナリングの下流遺伝子群が得られていた。これらの遺伝子群のうち特に発現変動の大きいもの10個について尾切断後の再生過程における経時的な発現量変動を定量RT-PCRにより解析したところ、全ての遺伝子が尾切断とともに発現誘導され、再生芽が顕著となる切断３日後までに発現量のピークを迎え、再生が収束へ向かう５日後までにその発現量が低下するという、再生の進行とよく相関する発現量変動を示した。またそのうち５つについて再生尾での発現部位をin situ hybridizationにより解析したところ、再生中の組織での顕著な発現が観察された。再生におけるIL-11シグナリング下流で、未分化細胞の維持機構に関わる実働分子である可能性を検討している。(3)また、IL-11を受容する細胞の再生尾形成への寄与を解析する目的で、IL-11受容体モザイクノックアウト個体における再生尾組織中のIL-11受容体欠損細胞の存在率の検討を計画した。これに先立ち、CRISPR/Cas9法によるIL-11受容体α鎖遺伝子(il-11ra)のモザイクノックアウト個体作出を行ったところ、この個体はil-11ノックダウン個体と同様（であるがよりシビアな）の尾再生阻害を示した。これよりil-11raモザイクノックアウト作出系の構築が為された。
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| 今後の研究の推進方策 |
未分化細胞の誘導・維持機構の実働分子の探索については、尾再生における各組織（脊髄・脊索・筋肉）由来の再生芽細胞の遺伝子発現プロファイルを作成し共通している因子の探索を計画している。具体的には、ユビキタスにGFPを発現するツメガエル初期胚より各組織の予定領域を野生型初期胚へ移植し、特定組織がGFPで標識された幼生を得る。この尾を切断し、各組織由来の（標識された）再生芽細胞をセルソーターにて回収する。これを脊髄・脊索・筋肉について行い、各組織由来再生芽細胞の遺伝子発現プロファイルをRNA-seqにより作成する。各プロファイル中に、IL-11シグナリング下流のものと共通するものを探索する。IL-11を受容する細胞の再生尾形成への寄与の解析については、il-11raモザイクノックアウト幼生の尾を切断し再生尾を回収、発生により形成された切断前の尾と再生尾とでゲノムil-11ra遺伝子の変異導入効率をシークエンスにより算出、再生尾に存在するIL-11受容体欠損細胞の率を推定する。これに先立ち、il-11raモザイクノックアウト幼生はシビアな再生尾短縮を示すため、再生尾の回収ができる程度に表現型を弱めるための条件検討（顕微注入するcas9 mRNA濃度とguide RNA濃度を下げる）を行う。また、再生尾におけるil-11ra発現細胞の局在、またその再生過程での変遷についてin situ hybridization法を用い解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ツメガエル幼生尾再生不応期型免疫応答の攻撃実体と攻撃対象を探索するためのRNA-seq解析を行った。これにより得られた結果の再現性を確認するためにRNA-seqを追加で行う必要が生じたため、補助事業期間を延長した。
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