| 研究課題/領域番号 |
16K14618
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
青木 勝彦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (80328278)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | がん / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、細胞の生存に必須な遺伝子のリストを作成し、その中から、がんの治療に直結する分子標的を同定することである。ゲノム編集技術を利用してがん細胞の遺伝子を網羅的に破壊し、遺伝子破壊の結果として死んだ細胞由来のDNA情報から次世代シーケンサーを用いて生存必須遺伝子を同定する。それによって、全てのがん細胞に普遍的な弱点（生存必須遺伝子）を明らかにし、その情報を複数のがん細胞株間で比較することにより、個別のタイプのがん細胞に特徴的な弱点（治療標的候補）を見つけ出す。本年度は培養上清中に放出された死細胞由来のゲノムDNA断片を回収する方法の確立と、そこからゲノムDNA上に存在する標的遺伝子を増幅する方法の確立を目指した。まず、ゲノム編集を用いた実験系を確立するためのモデル実験系（卵巣癌細胞株A2780とそのアドリアマイシン耐性株であるA2780ADRを利用）を構築した。GFP遺伝子を導入したA2780細胞（A2780GFP）とA2780ADR細胞をアドリアマイシン存在下で共培養するとA2780GFP選択的に細胞死が誘導され、その結果としてA2780GFPのゲノムDNAが培養上清中に放出されるはずである。DNA抽出法を検討した結果、実際に培養上清から短鎖のゲノムDNA（約200bp）を精製することが可能であった。精製したゲノムDNA断片に対してPCRを行ったところGFP遺伝子の断片を検出することができた。また、このモデル実験系構築の過程では培養上清中のゲノムDNAの安定性に関する情報や検出感度に関する情報を得ることができた。以上の結果は死細胞由来のゲノムDNAを対象とした解析が実施可能であることを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究立案時の最大の懸念事項であった死細胞由来のゲノムDNAを解析対象とすることについては、本年度の研究結果から実施可能であると考えられ、実験系構築の目処が立ったと考えている。しかし、ライブラリーを用いた網羅的な解析を行うためにはさらなるスケールアップのための条件検討が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
実験系のスケールアップを行い、今年度に構築したモデル実験系を用いてゲノムワイドスクリーニングを実施する。その結果として、MDR1等のアドリアマイシン耐性遺伝子に対するガイドRNA配列を培養上清中から検出できれば、本研究課題を遂行するための実験系構築が成功したと判断する。実験系の構築後は、タイプが異なる複数の大腸癌細胞株を用いて生存必須遺伝子の探索を行い、治療標的候補を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、研究遂行のためのモデル実験系の構築に時間を費やし、次世代シーケンサーを用いたスクリーニングを行わなかったため、その費用が次年度使用額として生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度の研究によって研究遂行のための実験系構築に目処が立った。次年度は次世代シーケンサーを用いた実験と解析がメインとなる。次世代シーケンサーを用いた実験には比較的高額な試薬や解析系を構築するための計算機が必要である。次年度使用額と翌年度分として請求した助成金はこれらの購入に使用する。
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