| 研究課題/領域番号 |
16K14636
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
小倉 潔 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 主任研究員 (70233492)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 腫瘍増殖抑制 / 足場非依存的増殖 / ESCRT |
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| 研究実績の概要 |
ESCRTはESCRT-0, -I,-II, -IIIから構成され、ユビキチン化タンパク質を細胞質から小胞体内へ輸送する多小胞体形成能、Wnt-シグナル伝達を担っている。HGS(O14964) は、STAM (Q92783) とそれぞれのコイルドコイル領域 (HGS/CとSTAM/C) を介して結合することにより、ESCRT-0を形成し、ESCRTを構成する。
申請者はHGSの研究から、HGSが発がん因子・がん特性の増悪化因子であり、さらに、HGSのコイルドコイル領域（HGS/C）はがん特性抑制因子として機能することを発見した。HGS/Cを高発現させたがん細胞は、細胞培養基質上では、親細胞株と遜色ない増殖能を示すが、超低接着基質上や軟寒天培地中、ヌードマウス皮下では増殖できない。
HGS/Cは、がん特性である足場非依存的増殖能だけを抑制した。さらに、HGS/Cを構成するオリゴペプチドを検索し、足場非依存的増殖能を抑制するOP10-11を見いだした。OP10-11はマウス尾静脈投与によりCOLO205細胞のヌードマウス皮下での腫瘍増殖を抑制した。このように、HGSやESCRT-0は、がん特性である足場非依存的増殖能だけを抑制することのできる腫瘍増殖抑制剤の分子標的となり得る。そこで、本研究では、HGS/CとSTAM/Cの結合阻害を指標とする分割蛍光蛋白システムを用いて、ESCRT-0を分子標的として、ESCRT 活性-Wntシグナル伝達-足場非依存的増殖を阻害する低分子化合物を探索することを目的とした。
本年度は単量体蛍光蛋白質monomeric Kusabira-Green(mKG)をレポーター分子として利用する分割mKGアッセイシステムを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、ESCRT-0を分子標的としてHGS/CとSTAM/Cの相互作用を阻害する低分子化合物を探索する方法により、Wntシグナル伝達を阻害し、腫瘍増殖を抑制する低分子化合物を探索する。
本研究では単量体蛍光蛋白質monomeric Kusabira-Green(mKG)をレポーター分子として利用した。mKG蛋白質を２つに分割したmKG-N蛋白質とmKG-C蛋白質に、HGS/C蛋白質とSTAM/C蛋白質それぞれ融合することにより、分割mKGアッセイシステムを作製する。HGS/C蛋白質とSTAM/C蛋白質同士が相互作用すると、分割したmKG-N蛋白質とmKG-C蛋白質が近接して、mKG蛋白質が再構成される、その結果、蛍光能を回復することにより、相互作用を蛍光シグナルとして検出できる。この分割mKGアッセイシステムにおいて、HGS/C蛋白質とSTAM/C蛋白質の相互作用を阻害する低分子化合物を検索する。
本年度では、このHGS/C-STAM/C分割mKGアッセイシステムを作製した。① mKG-N蛋白質とmKG-C蛋白質、HGS/C蛋白質とSTAM/C蛋白質の融合最適化 mKG-N蛋白質とmKG-C蛋白質、HGS/C蛋白質とSTAM/C蛋白質の融合蛋白質の配列組み合わせを検討し、mKG-N-HGS/C蛋白質とSTAM/C-mKG-C蛋白質の配列組み合わせを選択した。mKG-N-HGS/C蛋白質とSTAM/C-mKG-C蛋白質をカイコ系により大量合成し、以後の研究に用いた。② 分割mKGアッセイシステムの最適化 アッセイプレート、アッセイ容量、スクリーニング化合物量の最適化を行い、一次スクリーニングアッセイ系を構築した。 ③この一次スクリーニングアッセイ系を用いて、当研究所所有の既存薬ライブラリーのスクリーニングを開始した。
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| 今後の研究の推進方策 |
① 作製したHGS/C-STAM/C分割mKGアッセイシステムを用いて、当研究所所有の既存薬ライブラリー、および、公共サプライヤーから低分子化合物ライブラリーをHGS/C-STAM/C分割mKGアッセイシステムを用いて、低分子化合物スクリーニングを行う。
② 各ライブラリーからのヒット化合物をin vitro系、in vivo系において腫瘍増殖抑制効果を検証し、リード化合物を選出する。
1. in vitro系での検証 - Ultra Low Attachment surface plate（ULA-plate）での腫瘍増殖抑制効果の検証 ULA-plateでは足場非依存的増殖能を有するがん細胞しか増殖できない。ULA-plateでのみ、がん細胞増殖を抑制できるヒット低分子化合物を選定する。
2. in vivo系での検証 - ヌードマウスXenograftモデルでの検証 in vitro系での検証により、選択されたヒット低分子化合物を尾静脈投与し、ヌードマウス皮下腫瘍に対する腫瘍増殖抑制効果を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度において、HGS/C-STAM/C分割mKGアッセイシステムを作製した。 そのために、mKG-N蛋白質とmKG-C蛋白質、HGS/C蛋白質とSTAM/C蛋白質の融合最適化を行った。当初予定では、mKG-N蛋白質とmKG-C蛋白質、HGS/C蛋白質とSTAM/C蛋白質の融合蛋白質の配列組み合わせを検討は、シスメック社のProCubeシステムによる合成蛋白質を用いることを計画していた。しかし、実際には培養細胞発現レベルでの融合蛋白質の配列組み合わせ実験を用いて検討を行った。そのため、蛋白質合成のための外部委託費が減額できた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度においても、シスメック社のProCubeシステムによる合成蛋白質を外部委託する。その時に合成蛋白質量を増大させるために、カイコ数を増加させるオプション費に差額を充填することを計画している。
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