研究課題
イネ胚盤由来カルスの無細胞タンパク質合成系の確立に成功し、GTP依存性に関し試験を進めた結果、これまでにATP添加条件においてGTPの有無に無関係で試験タンパク質GFPの合成が可能であることを確認した。poly(U)を鋳型とする翻訳伸長活性測定では、GTP添加が伸長反応活性を阻害することを確認した。さらに、この活性がシクロへキシミドにより阻害されることより、観察している活性が確かに細胞質由来の80Sリボソーム翻訳系のものであることを合わせて確認した。この新たに確立したイネカルス無細胞翻訳系は、1 mlあたり数百マイクログラム相当のタンパク質合成が可能であり、脂質二分子膜ベシクル添加条件でのヒト心筋に存在する重要なカリウムチャネルタンパク質hERGの合成も可能であることを確認した。hERGは同年度内にコムギ無細胞翻訳系で調製し、カリウムイオンチャネルとして機能することを示し報告済みである（Tadaaki et al. Sci Rep. 7: 17736, 2018）。以上のように、イネカルス抽出液はコムギ胚芽抽出液に準ずる生化学的なタンパク質調製ツールとしての利便性も併せ持つことより、他の特性も考慮の上、共同研究契約を結ぶ企業と特許申請する予定で準備を進めている。研究計画では、H29年度には翻訳開始因子を対象とする解析を予定していたが、この年度内には、パン酵母および大腸菌の無細胞翻訳系をそれぞれ独自に準備し、GTP依存性をイネカルスおよびコムギ胚芽の抽出液のものと比較を行った。その結果、大腸菌では完全なGTP依存性を確認し、酵母においてもGTP添加が活性をより亢進させることを見出し、イネおよびコムギの系との大きな相違をみた。特に真核生物である酵母の無細胞系においてはGTPの伸長阻害効果が見られず、イネとコムギの系と明瞭に異なることが観察された。
2: おおむね順調に進展している
イネカルスに加え、パン酵母および大腸菌の無細胞タンパク質合成系を確立し、比較対象が増えたことにより、我々が見出したコムギ胚芽抽出液のGTP依存性に関する疑問をより明瞭にする基盤実験系ができたと考えている。計画と照らし合わせると遅れている部分があるが、イネカルス抽出液を利用する無細胞翻訳系が予想外に高い活性を示し、今後の応用に道が拓け、企業も関心を示し特許化に向け準備が進んでいる。挑戦的な方向性という点で評価していただけると信じ、この自己評価とした。
申請時に記載したH29以降の研究計画の項目で、翻訳開始因子と翻訳伸長反応因子のクローニングと組換えタンパク質のATPase活性解析を計画通りに遂行し、タンパク質レベルでのGTPaseおよびATPase活性の比較解析を完了させる。最終年度のため、必要データを収集し、イネカルス抽出液を材料とする無細胞翻訳系技術の特許出願と、その論文の投稿を完了させる。また、コムギ胚芽抽出液およびイネカルス抽出液のGTP無添加条件での翻訳活性に関する論文の投稿も完了する。これらの成果は日本分子生物学会および日本農芸化学会において発表する。
すべて 2018 2017
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件)
Scientific Report
巻: 7 ページ: 17736
10.1038/s41598-017-17905-x
