植物種子細胞に見られるATP依存型翻訳活性の分子機構解明

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K14665
• 研究機関: 埼玉大学
• 研究代表者: 戸澤 譲 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (90363267)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 無細胞タンパク質合成 / イネ / GTP / カルス

研究実績の概要

昨年度までに、イネ胚盤由来カルスの細胞抽出液の製造法を確立させ、これを利用する無細胞タンパク質合成系を確立した。これまでに、GTP無添加条件でのタンパク質合成が可能であることを確認した一方、抽出液内在性のヌクレアーゼによるmRNA分解の結果生じるGMPよりGTPが生成することをラジオアイソトープ標識実験により確認した。そこで、GTPが翻訳に必須な機能を果たしているのか否かを検証するため、グアニンを含まないmRNAとしてpoly(U)を鋳型とする翻訳伸長活性測定を進め、GTP添加が伸長反応活性を阻害するという想定外の結果を得た。さらに、この活性がシクロへキシミドにより阻害される細胞質由来の翻訳系によることを確認した。並行して、パン酵母および大腸菌の無細胞翻訳系のGTP依存性をイネカルスおよびコムギ胚芽の抽出液のものと比較を行った結果、大腸菌では完全なGTP依存性を、酵母においてもGTP添加が活性をより亢進させることを見出し、イネ・コムギ系との相違をみた。特に酵母の無細胞系においてはGTPの伸長阻害効果が見られず、イネとコムギの系と明瞭に異なることを観察した。
新たに確立したイネカルス無細胞翻訳系は、1 mlあたり数百マイクログラム相当のタンパク質合成が可能で、精製用ヒスチジンタグの利用による合成タンパク質の精製も可能であり、生化学的機能解析用のタンパク質合成系に実用化できる生産性を有すると考える。また、前年度に確認した脂質二分子膜ベシクル添加条件でのヒト心筋カリウムチャネルタンパク質hERGの合成については、さらにその多量体形成促進因子との共合成により、活性型タンパク質の効率的再構成系の構築も可能であることを確認し、難合成タンパク質の機能型再構成系の構築にも資することを確認できた。
最終年度には生化学的な検証に必要なデータの収集を完了した。

研究成果

• [雑誌論文] Novel lineage-specific transmembrane β-barrel proteins in the endoplasmic reticulum of Entamoeba histolytica. (2019)
  • 著者名/発表者名: Herbert Santos, Kenichiro Imai, Takashi Makiuchi, Kentaro Tomii, Paul Horton, Akira Nozawa, Kenta Okada, Yuzuru Tozawa, Tomoyoshi Nozaki
  • 雑誌名: FEBS J 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/febs.14870
  • 査読あり
• [雑誌論文] The checkpoint kinase TOR (target of rapamycin) regulates expression of a nuclear-encoded chloroplast RelA-SpoT homolog (RSH) and modulates chloroplast ribosomal RNA synthesis in a unicellular red alga. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sousuke Imamura, Yuhta Nomura, Tokiaki Takemura, Imran Pancha, Keiko Taki, Kazuki Toguchi, Yuzuru Tozawa, Kan Tanaka
  • 雑誌名: Plant J 巻: 94 ページ: 327-339
  • DOI: 10.1111/tpj.13859.
  • 査読あり
• [雑誌論文] N-myristoylation and S-acylation are common modifications of Ca2+ regulated Arabidopsis kinases and are required for activation of the SLAC1 anion channel. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shunya Saito, Shin Hamamoto, Koko Moriya, Aiko Matsuura, Yoko Sato, Jun Muto, Hiroto Noguchi, Seiji Yamauchi, Yuzuru Tozawa, Minoru Ueda, Kenji Hashimoto, Philipp Koster, Qiuyan Dong, Katrin Held, Jorg Kudla, Toshihiko Utsumi, Nobuyuki Uozumi
  • 雑誌名: New Phytol 巻: 218 ページ: 1504-1521
  • DOI: 10.1111/nph.15053.
  • 査読あり
• [学会発表] Cell-free translation system: a tool for producing proteinous nanomachines (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuzuru Tozawa
  • 学会等名: 10th International Workshop on Nanostructures & Nanoelectronics
  • 国際学会
• [学会発表] ポリイソプレン鎖合成系の完全インビトロ再構成を目指して (2019)
  • 著者名/発表者名: 戸澤譲
  • 学会等名: 第二回天然ゴム研究会「天然ゴムから考えるバイオマテリアルエンジニアリングのこれから」
• [学会発表] Proteinous nanodevise production based on in vitro translation system (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuzuru Tozawa
  • 学会等名: Okinawa Colloids 2019
  • 国際学会 / 招待講演