| 研究課題/領域番号 |
16K14692
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
島田 奈央 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (90596850)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞情報伝達機構 / BARドメインタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度精製した細胞性粘菌のBARドメインタンパク質であるslp(Syndapin-like protein)またはnlp(Nwk/Bzz1p-like protein)を内包する水滴を油相中に作成し、これにガラスニードルを用いて、油相ー水相間に形成される脂質一枚膜の形状に摂動を与え、その膜局在量について蛍光顕微鏡にて観察を行った。ここで用いた油相には、slpの結合しうるリン脂質の混合組成であるフォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン,フォスファチジルイノシトール(4,5)-ビスリン酸を含めた。slpのBARドメイン領域のRFPタグタンパク質(slp-BAR-RFP)を含む水滴表面に、ガラスニードルの先端をあて減圧により膜をニードル内に引き込むと、膜上の蛍光輝度の上昇が観察されたことから、slp-BAR-RFPは膜曲率に依存して局在することが示された。また、精製nlpのRFPタグタンパク質を含む水滴では、水滴表面のたわみや形状の歪みがしばしば生じていた。これは膜変形または維持する機能を有することを示唆しており、本課題における膜変形のツールとして使用しうることを示している。
一方でslpの生体内における機能について調べるため、slp遺伝子破壊株の作製とslp全長のRFPタグを粘菌細胞で発現させ局在の解析を行った。その結果、slpは形質膜にパッチ状に、slp-BARは形質膜と核の周辺に局在していた。細胞性粘菌は貧栄養環境下におくと多細胞期へ移行し細胞同士が接着して集団的に運動する様子が観察されるが、slpは前後に連なる後ろ側の細胞の前端に線状に局在が観察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまで精製したslp, nlpタンパク質をリポソームおよび油相中の水滴を形成させることで、その結合のリン脂質特異性と脂質膜の曲率依存性、その膜変形能について明らかにしてきた。本課題ではこのslp, nlpによる膜変形条件下で、低分子量Gタンパク質一種であるRasのGEFによる活性化反応およびその下流の因子であるPI3Kなどの酵素反応を行うが、これらについてのGSTタグのコンストラクトを作製し粘菌細胞で発現を試みたが収量がふるわず、別のタグを用いた精製法を検討中である。これが上記の区分を選択した主な理由である。
一方で、PI3Kの膜上における反応を検出する、つまりPI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3を検出する蛍光プローブであるGSTタグPHドメインの発現および精製を大腸菌を用いて行い、その脂質選択性については検証済みである。
また、上記のタンパク質の発現と精製に時間がかかっていることと、本年度ガラスニードルで局所的に膜変形を行うことでslpの膜局在量が変化し、これを応用することで油層中の水滴全体の膜変形が誘導されることの期待が高まったため、光誘導性BARドメインタンパク質についてはコンストラクトを設計するに留めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きRasやGEF、PI3Kの精製タグの検討と精製を行う。油相中の水滴における精製slpおよびnlpの濃度と膜の変形度について議論し、ガラスニードルを用いて局所的に変形により水滴全体の変形が引き起こされる条件を検討する。
今年度はslpの細胞内での機能についても解析を行った。これらの細胞内局在が、油相中の水滴と同様に、細胞に細胞にニードルをあてて膜変形を誘導した場合や、浸透圧変化やアクチン骨格阻害剤を加えることで細胞形状を変化させることで、どのように変化するかを明らかにする。また得られたslp遺伝子破壊株の表現型を同定し、その機能を明らかにし、あわせて考察する。nlp遺伝子破壊株および、slp/nlp遺伝子破壊株の作製を試み、同様に表現型の解析を行う。
万一、RasやGEFの精製がうまくいかなかった場合は、クルードな実験系になるが、slp/nlp遺伝子破壊株の細胞質抽出液を用いて油相中の水滴を作製し、それに精製slp,nlpを加えたものと加えなかったもので膜変形とPIP3量の変化を比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、RasやGEF、PI3Kの発現および精製の収量をあげるためのプラスミドコンストラクションに時間がとられた。これらはクローニングなどの分子遺伝学実験および精製のための大腸菌ないし細胞性粘菌の培養などを小スケールにて条件検討を行ったため、精製のスケールアップをあまり行わなかった。よって精製に必要な担体などの購入費用が抑えられたためである。
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