| 研究課題/領域番号 |
16K14696
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
田嶌 優子 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (10423104)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | GPIアンカー型タンパク質 / 細胞内輸送 / ゴルジ装置 |
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| 研究実績の概要 |
糖脂質GPI (Glycosylphosphatidylinositol)は、翻訳後修飾として親水性タンパク質を細胞膜につなぎ止め、その輸送や機能に深く関与する。GPIアンカー型タンパク質(GPI-Anchored Proteins; GPI-APs)は150種ほど知られ、小胞体で合成された後、ゴルジ装置でGPI脂質の構造変化を受ける。一連の生合成反応の経路は、詳しく研究されてきたが、輸送経路は、生細胞内でGPI-APsの動態を経時的に定量化する方法が限られていたため、よくわかってない。
本研究の目的は、GPI-APsの動態を生細胞で空間的・経時的・定量的にモニターする方法をRUSH(Retention using selective hooks)法を応用して新たに確立し、CRISPR/Cas9 システムを用いたsingle guide RNA(sgRNA)ライブラリーと次世代シークエンサー解析を組み合わせて、ゴルジ装置から細胞膜へのGPI-APsの輸送に働く遺伝子を一度に網羅的に同定することである。
RUSH法では、レポータータンパク質にストレプトアビジン結合部位(Sb)を導入し、フックタンパク質にストレプトアビジン(St)を導入して、両タンパク質の結合をビオチンの有無で制御する。申請者は、レポーターGPI-APsにSbとFlagタグを導入し、ゴルジ装置フックタンパク質としてMannosidase IIにStとHAタグを導入し、ゴルジ装置局在フックタンパク質とレポーターGPI-APsの発現を、Tet-onシステムで誘導できるHEK293細胞株を樹立した。そして、レポーターGPI-APsのゴルジ装置での繋留の確認と、細胞表面への輸送を検出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年度にHEK293細胞とHeLa細胞をもとにレポーター細胞株を樹立し、平成29年度は、このレポーター細胞株について詳細に検討した。この温度感受性レポーターVFSbE-GPI (温度感受性VSVG、Flagタグ、EGFPとGPI付加シグナルの融合タンパク質)は、温度感受性部位を利用せずに32℃培養による一度の繋留で、細胞表面でフローサイトメトリーにより十分に検出できる量を蓄積できたが、レポーターVFSbE-GPIとフックタンパク質との結合が不十分で、レポーターVFSbE-GPIの細胞表面への漏れを検出した。そこで、温度感受性部位を持たないレポーターGPI(Sb-Flag-mEGFP-GPI)に改良し、さらに、フックタンパク質ManII-Str-HAとレポーターGPIをIRES配列でつなぎ、両タンパク質をTet-onシステムで発現するプラスミドを作成した。この発現プラスミドをHEK293細胞株に導入し、細胞株を樹立した。ドキシサイクリン処理により、フックタンパク質ManII-Str-HAとレポーターGPIが発現すること、また両タンパク質が免疫沈降法により共沈することをウエスタンで確認した。また、フックタンパク質の細胞内局在と、レポーターGPIのビオチンの有無による局在変化を検出した。ビオチン添加前に細胞表面へのレポーターGPIの漏れがないこと、ビオチン添加後にレポーターGPIが細胞表面に十分量に発現することをフローサイトメトリーで確認した。他に、スクリーニング実験に向けて、sgRNAライブラリーの準備、レンチウイルスによるトランスフェクション条件の検討を行った。
以上のように、計画を変更したが、当初の目的に向かって進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年に樹立した細胞に、レンチウイルスを用いてCas9ヌクレアーゼを利用したsgRNAライブラリーを遺伝子導入し、変異細胞ライブラリーを作製する。この変異細胞ライブラリーから、ゴルジ装置から細胞膜へのレポーターGPIの輸送が遅れる細胞をセルソーターで選別する。セルソーテイングを繰り返して変異細胞を濃縮した後、この変異細胞群からゲノムを抽出する。ゲノムに含まれるsgRNA配列を次世代シークエンサーで同定する。sgRNAライブラリーを導入しないで、同様のセルソーテイング処理した細胞から抽出したゲノムをコントロールとし、検出されたsgRNA配列の中で、変異細胞群で濃縮されている遺伝子を候補遺伝子とする。得られた候補遺伝子がGPI-APsの輸送の遅れを引き起こす責任遺伝子であることを確認するために、レポーター細胞に候補遺伝子のノックアウトを改めて導入した細胞株を樹立し、ゴルジ装置から細胞表面へのレポーターGPIの輸送を定量する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者が所属研究所を異動し、新しい所属研究室での実験系のセットアップに時間を要したため、研究計画の遂行に遅れを生じた。また、新しい所属先には、セルソーターの委託システムがなく、その技術習得に時間を要した。予算は、次世代シークエンサーによる候補遺伝子の解析費に使用する予定である。
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