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糖脂質GPI (Glycosylphosphatidylinositol)は、翻訳後修飾として親水性タンパク質を細胞膜につなぎ止め、その輸送や機能に深く関与する。GPIアンカー型タンパク質(GPI-anchored proteins; GPI-APs)は小胞体で合成された後、ゴルジ装置でGPI脂質の構造変化を受ける。一連の生合成反応の経路は、詳しく研究されてきたが、輸送経路は、生細胞内でGPI-APsの動態を経時的に定量化する方法が限られていたため、よくわかってない。本研究の目的は、GPI-APsの動態を生細胞で空間的・経時的・定量的にモニターする方法をRetention using selective hooks(RUSH)法を応用して新たに確立し、ゴルジ装置から細胞膜へのGPI-APsの輸送に働く遺伝子を一度に網羅的に同定することである。
研究代表者は、RUSH法に基づいて、レポーターGPI-APsにストレプトアビジン結合部位とFlagタグを導入し、ゴルジ装置フックタンパク質としてMannosidase IIにストレプトアビジンとHAタグを導入して、両タンパク質をTet-onシステムで発現誘導できるHEK293細胞株を樹立した。レポーターGPI-APsのゴルジ装置での繋留と、ビオチン添加による両タンパク質の結合の解除によってレポーターGPI-APsが細胞表面へ運ばれることを確認した。この細胞にCRISPR/Cas9とsingle guide RNAライブラリーをレンチウイルスを用いて導入し、変異細胞集団を作成した。この変異細胞集団から、レポーターGPI-APsの細胞表面への輸送が遅れる細胞をセルソーターで選別して集めた。濃縮された変異細胞集団からゲノムを抽出し、ゴルジ装置から細胞膜へのGPI-APsの輸送に働く候補遺伝子について次世代シークエンサーで解析している。
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