| 研究課題/領域番号 |
16K14700
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
水島 恒裕 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (90362269)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / 酵素反応 / ユビキチンリガーゼ / エフェクター |
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| 研究実績の概要 |
腸管病原細菌は宿主への感染に際し、エフェクターと呼ばれるタンパク質を宿主に分泌することで宿主の防御機構を阻害し、感染を拡大している。赤痢、サルモネラ、エルシニア菌などの病原細菌中に、ユビキチン修飾経路において基質にユビキチンを付加する役割を担うユビキチンリガーゼ(E3)機能を持ったエフェクターの存在が報告されている。IpaHファミリーは哺乳類には存在しない新しいタイプのNovel E3 ubiquitin ligase (NEL)ドメインとロイシンリッチリピート(LRR)ドメインを持ち、NELドメインにより宿主の防御経路に関わるタンパク質にユビキチンを付加し分解へと導く。また、エルシニア属細菌のYopMはN末側のαヘリックスとLRRドメインからなり、NELドメインとは異なる構造モチーフによりE3活性を示す。
病原細菌の持つ新規E3の機能発現機構解析のため、E3活性が報告されたものと同じ株由来のYopMの結晶構造解析を行い分解能2.7Åで構造を決定した。また、YopMの機能の研究において、YopMはN末側に存在するCXDモチーフ中のCysをAlaに変異することにより、E3活性が減少することが報告されていたことから、YopMのCysをAlaに変異させた変異体タンパク質の発現系を作製し、結晶化を行った。
IpaHファミリーの持つNELドメインの研究では、IpaHと親和性の高いE2を探索し、NELドメインとE2の複合体結晶化を行った。しかし、得られた結晶はNEL単独状態のものであった。そのため、NELドメインとE2酵素であるUbcH5を、リンカーを介し共有結合により融合したタンパク質の発現系を作製し、精製、結晶化を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
新規にユビキチンリガーゼ(E3)機能を持つことが報告された、N末αヘリックスとロイシンリッチリピート(LRR)からなるYopMの野生型結晶構造解析を行った。さらに、E3機能に関与するCXDモチーフに変異を導入したYopM変異体の発現、精製系を構築し結晶化を行った。また、赤痢、サルモネラ、エルシニア等に保存されるNovel E3 ubiquitin ligase (NEL)ドメイン単独状態の結晶化に成功すると共に、NELドメインとユビキチン結合酵素を融合したタンパク質発現系を構築した。
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| 今後の研究の推進方策 |
IpaHファミリーの機能発現機構の解析は順調に進行しており、NELドメインとE2酵素を共有結合により融合したタンパク質の精製系を作製した。今後の研究ではこれらタンパク質の精製、結晶化を行い、構造解析を進める。また、病原細菌の新規E3モチーフの研究として、YopM単独状態の構造解析に成功しており、機能部位に変異を導入したYopM変異体の構造解析を行い、野生型との構造比較から機能発現機構の解析を進める。さらに、YopMとE2酵素の複合体の結晶化、構造解析を行う計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年度の研究実施計画として、IpaHファミリーユビキチンリガーゼのNELドメインとE2酵素の複合体構造解析、LRRドメインの構造学的研究、新規E3ドメインを持つYopMの構造解析を進めた。しかし、これら研究の進行中に、使用していたタンパク質精製装置の故障（2017年11月）があり、精製、結晶化実験の進行に遅れがでた。また、サンプルや培養した大腸菌を保存していた冷凍庫の故障（2018年1月）により、準備していたサンプルが使用不能となり研究計画に遅れが生じた。これらのことから培養、精製、結晶化のために計画した予算を繰り越すこととした。
LRRドメインの構造学的研究、CLDモチーフからなる新奇E3の研究において、計画に遅れの生じた構造解析を進めるため、タンパク質の精製、結晶化、構造解析に予算を使用する。また、NEL型E3とE2酵素の複合体構造解析研究のため、E2、NELの発現系構築、培養、精製、結晶化に用いる試薬類に使用する計画である。
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