| 研究課題/領域番号 |
16K14706
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
上野 博史 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (10546592)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 1分子計測・操作 / 分子モーター |
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| 研究実績の概要 |
前年度までにE. hiraeのVoV1は可溶化状態においても外部のナトリウム濃度の低下に伴い回転速度が低下することが分かった。V1のみではこのような回転速度の低下は観察されないことから、これは低濃度ナトリウム領域では、Voでのナトリウム結合が律速になることを示唆している。いくつかの分子は、低ナトリウム濃度条件において、9～10点の多点の回転ステップを示した。このステップ数は、E. hirae VoV1のVo部位の構造から予想される回転ステップサイズと近い値であることから、観察されたステップ回転はVoでのナトリウム結合を反映したものであると考えられた。しかしながら停止時間に比べて停止状態の角度揺らぎが大きく、停止時間の定量的な解析までは至っていなかった。そこで本年度は固定するタグの位置由来の揺らぎを抑えることを目的とし、固定に用いるタグの位置を変えた変異体を複数作製した。VoV1の外側のストーク部分にbiotin化タグを入れたものや、Vo-aにbiotin化タグを入れたもの、従来のタグのリンカー配列をかえたものなどを作製し回転観察を行った。その中で、リンカー配列を変えたものがATP飽和・低濃度ナトリウム条件でATP加水分解由来の３点の停止が明確に見えないほど回転が遅くなることが分かり多点ステップが比較的明確に見えた。現在この結果を解析中である。さらにナトリウムの結合を遅くするために、結合に重要だと考えられているVo-cの残基に変異をいれた変異体の1分子回転観察にも成功している。こちらについても現在解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
ナトリウム輸送由来の回転停止の検出やVo由来の回転ステップサイズの検出には成功しているが、停止時間の定量的な解析に時間がかかってしまったため、平成２９年度に行う予定であった平面支持膜内でのE.hirae VoV1回転観察系の構築が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
リンカーの検討により改善したVo由来の停止の定量計測を進めつつ、今後はE. hirae VoV1の平面支持膜内での回転観察系の構築を行うとともに、ナトリウム濃度の計測方法や濃度差・膜電位の制御方法を新規に開発する。さらに開発した実験系を組み合わせ、回転と基質濃度の同時計測が可能な複合計測系の構築を行う。また膜電位またはΔpNa存在下において回転の計測を行う。膜電位と、ΔpNaがATP駆動の回転にどのように影響を与えるのかを詳しく調べることで、Voでの回転エネルギー変換機構についての手掛かりを得る。最終的にはこれまで得られたE. hirae VoV1のATP駆動の回転のナトリウム濃度依存性と、膜電位・ΔpNaへの応答で得られた知見を総合的に解釈することでVoV1の回転イオン輸送機構の解明を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末の緊急を要する消耗品の購入や機器の故障に対応するため、予算に余裕を持たせていた。年度末ぎりぎりに無理に使用するよりも次年度に合算して研究に必要な物品の購入にあてるべきと考え次年度使用額が生じた。次年度の消耗品の購入にあてる。
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