| 研究課題/領域番号 |
16K14709
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
今村 博臣 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | BRET / 生物発光 / ライブイメージング / ATP |
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| 研究実績の概要 |
平成２８年度の研究実施計画として、（１）新規発光型ATPバイオセンサーの開発と（２）その特性解析及び培養細胞への導入を掲げていた。研究計画（１）については、発光タンパク質としてATP非消費型ルシフェラーゼであるnanoLucと蛍光タンパク質としてYFPのmVenusを用い、ATP濃度依存的構造変化を引き起こすεドメイン（Bacillus subtilis由来ATP合成酵素の一部）とそれらを結合させることにより達成した。作製したバイオセンサーはnanoLucの発光基質と反応し、主に青色の波長が検出される発光反応を示し、反応環境におけるATP濃度依存的にmVenusに由来した黄色波長の蛍光強度の変化が検出された。この波長変化率を用いて、ATP濃度を測定することが可能であった。研究計画（２）として挙げたBTeamの特性解析を行った結果、BTeamは他のヌクレオチド（GTP, CTP, UTP, ADP）とは反応せず、ATP特異的に反応することが分かった。また、pHは7.1-8.3の範囲で安定的にATPを測定できた。ATP測定可能範囲は、３７度条件下で約0.5-6.0 mMであった。BTeamの応答は温度依存性を示し、温度の上昇に伴い測定範囲が高くなった。このことから、BTeamによるATP測定には、厳重な温度管理が重要であることが分かった。BTeamを細胞に発現させ、培養液に発光基質を添加することで、細胞から発光反応が観察された、得られた発光スペクトルを解析することで、細胞内のATP濃度を定量することが可能であった。従来の蛍ルシフェラーゼによるATP測定方法とは異なり、発光反応を用いて生きた細胞のATP濃度を経時的に定量可能である点がBTeamの最大の強みと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初目標としていた２８年度研究実施計画はすべて完遂できた。従って、現在までの進捗状況は良好であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究実施計画として、植物へのBTeamの導入を予定している。具体的な研究計画は、申請書に記した通りであるが、第一の目標は光合成における生きた植物細胞内でのATP動態を観察することである。現在考えられる懸念点としては、発光イメージングの際、BTeamの発光反応自体が光合成に及ぼす影響が挙げられる。例えば、発光反応で生じる二酸化炭素や、また発光そのものが光合成を促進してしまう可能性も考えられる。しかし、発現量の調節や、BTeamの改変などによりうまく対応し、研究目的を達成する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究が当初の想定より順調に進み、消耗品等に使用する金額が予定を大幅に下回ったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度に新たに植物の発光イメージング系を立ち上げるために使用する予定である。
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