新規発光型ATPバイオセンサーによる光合成生物内ATP動態の定量的解析

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K14709
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 今村 博臣 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: BRET / ATP / 生物発光 / ライブイメージング

研究実績の概要

ATP非消費型発光タンパク質であるNanoLucと蛍光タンパク質mVenus、およびATP濃度依存的に構造変化を起こすεタンパク質（Bacillus subtilis由来ATP合成酵素複合体のサブユニット）を遺伝子工学的に融合することにより、新規BRET型ATPバイオセンサーであるBTeamを作成した。このバイオセンサーはNanoLucの発光基質と反応して発光し、ATP濃度に応じてBRET効率の変化が見られた。このBRET効率からATP濃度を測定することが可能であった。BTeamはATPに特異的に反応し、pH7.1-8.3の範囲で安定的にATPを測定することができた。37℃におけるATP測定可能範囲は約0.5-6.0 mMであった。BTeamを発現させた培養動物細胞のBRET効率をルミノメーターあるいは発光顕微鏡によって測定することで、生きた細胞のATP濃度を極めて高い定量性で経時的に測定できることが示された。続いてゼブラフィッシュにおいてBTeamの発現を試みた。ゼブラフィッシュ受精卵にBTeam遺伝子をマイクロインジェクションした結果、BTeamをモザイクに発現する個体が得られた。この個体にNanoLuc基質を投与し、個体レベルでBRET効率を測定できることが示された。現在、BTeamを全身で発現するF2世代の樹立を進めている。また、植物個体へのBTeamの発現をおこなうためのベクターを現在構築中である。

研究成果

• [雑誌論文] General anesthetics cause mitochondrial dysfunction and reduction of intracellular ATP levels. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kishikawa JI, Inoue Y, Fujikawa M, Nishimura K, Nakanishi A, Tanabe T, Imamura H, Yokoyama K.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 13 ページ: e0190213
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0190213.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Analysis of mitochondrial function in human induced pluripotent stem cells from patients with mitochondrial diabetes due to the A3243G mutation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Matsubara M, Kanda H, Imamura H, Inoue M, Noguchi M, Hosoda K, Kakizuka A, Nakao K.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 ページ: 949
  • DOI: 10.1038/s41598-018-19264-7.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Transient Rise in Free Mg2+ Ions Released from ATP-Mg Hydrolysis Contributes to Mitotic Chromosome Condensation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Maeshima K, Matsuda T, Shindo Y, Imamura H, Tamura S, Imai R, Kawakami S, Nagashima R, Soga T, Noji H, Oka K, Nagai T.
  • 雑誌名: Current Biology 巻: 28 ページ: 444-451
  • DOI: 10.1016/j.cub.2017.12.035.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Human AK2 links intracellular bioenergetic redistribution to the fate of hematopoietic progenitors. (2018)
  • 著者名/発表者名: Oshima K, Saiki N, Tanaka M, Imamura H, Niwa A, Tanimura A, Nagahashi A, Hirayama A, Okita K, Hotta A, Kitayama S, Osawa M, Kaneko S, Watanabe A, Asaka I, Fujibuchi W, Imai K, Yabe H, Kamachi Y, Hara J, Kojima S, Tomita M, Soga T, Noma T, Nonoyama S, Nakahata T, Saito MK.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 497 ページ: 719
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.02.139.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. (2017)
  • 著者名/発表者名: Trevisiol A, Saab AS, Winkler U, Marx G, Imamura H, Moebius W, Kusch K, Nave KA, Hirrlinger J.
  • 雑誌名: eLife 巻: 6 ページ: e24241
  • DOI: 10.7554/eLife.24241.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cell competition with normal epithelial cells promotes apical extrusion of transformed cells through metabolic changes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kon S, Ishibashi K, Katoh H, Kitamoto S, Shirai T, Tanaka S, Kajita M, Ishikawa S, Yamauchi H, Yako Y, Kamasaki T, Matsumoto T, Watanabe H, Egami R ほか25名
  • 雑誌名: Nature Cell Biology 巻: 19 ページ: 530-541
  • DOI: 10.1038/ncb3509.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] RLR-mediated antiviral innate immunity requires oxidative phosphorylation activity. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yoshizumi T, Imamura H, Taku T, Kuroki T, Kawaguchi A, Ishikawa K, Nakada K, Koshiba T.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 5379
  • DOI: 10.1038/s41598-017-05808-w.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] ATP Maintenance via Two Types of ATP Regulators Mitigates Pathological Phenotypes in Mouse Models of Parkinson's Disease. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nakano M, Imamura H, Sasaoka N, Yamamoto M, Uemura N, Shudo T, Fuchigami T, Takahashi R, Kakizuka A.
  • 雑誌名: EBioMedicine 巻: 22 ページ: 225-241
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2017.07.024.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Fusion protein analysis reveals the precise regulation between Hsp70 and Hsp100 during protein disaggregation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hayashi S, Nakazaki Y, Kagii K, Imamura H, Watanabe YH.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 8648
  • DOI: 10.1038/s41598-017-08917-8.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Visualization of long-term Mg2+ dynamics in apoptotic cells using a novel targetable fluorescent probe. (2017)
  • 著者名/発表者名: Matsui Y, Funato Y, Imamura H, Miki H, Mizukami S, Kikuchi K.
  • 雑誌名: Chemical Science 巻: 8 ページ: 8255-8264
  • DOI: 10.1039/c7sc03954a.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Distinct intracellular Ca2+ dynamics regulate apical constriction and differentially contribute to neural tube closure. (2017)
  • 著者名/発表者名: Suzuki M, Sato M, Koyama H, Hara Y, Hayashi K, Yasue N, Imamura H, Fujimori T, Nagai T, Campbell RE, Ueno N.
  • 雑誌名: Development 巻: 144 ページ: 1307-1316
  • DOI: 10.1242/dev.141952.
  • 査読あり
• [学会発表] Imaging of intracellular ATP level revealed pannexin1-mediated programmed ATP decrease in apoptosis (2017)
  • 著者名/発表者名: Imamura H, Sakamoto S, Yoshida T, Kakizuka A
  • 学会等名: 19th International Union for Pure and Applied Biophysics Congress / 11th European Biophysics Congress
  • 国際学会
• [学会発表] FRET型ATPセンサーを用いたショウジョウバエ神経細胞におけるATPの濃度と消費速度の可視化 (2017)
  • 著者名/発表者名: 津山泰一、坪内朝子、碓井理夫、今村博臣、上村匡
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] ルシフェラーゼ断片の相補的再構成を用いた新規発光ATPバイオセンサーの開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 松岡篤志、垣塚彰、今村博臣
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] ツメガエル卵細胞におけるATPの役割の検証 (2017)
  • 著者名/発表者名: 井尻貴之、岸川淳一、今村博臣、上野秀一、岩尾康宏、横山謙、佐藤賢一
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] FRET型蛍光バイオセンサーを用いたミトコンドリア分岐鎖アミノ酸輸送体の探索 (2017)
  • 著者名/発表者名: 中嶋瞳、吉田有希、垣塚彰、今村博臣
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] 分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーの開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 吉田有希、今村博臣
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] MPTPパーキンソン病モデルにおけるATP制御薬の発症緩和効果 (2017)
  • 著者名/発表者名: 中野将希、今村博臣、笹岡紀男、山本正道、上村紀仁、首藤敏之、渕上智弘、高橋良輔、垣塚彰
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] 出芽酵母の細胞内ATP濃度変動を制御する仕組み (2017)
  • 著者名/発表者名: 高稲正勝、今村博臣、吉田知史
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会