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2017 年度 実績報告書

オートファゴソーム外膜因子の同定と膜融合過程の解析

研究課題

研究課題/領域番号 16K14720
研究機関東京大学

研究代表者

山本 林  東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (80551283)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2018-03-31
キーワードオートファジー / 膜融合 / SNARE
研究実績の概要

オートファゴソームの生化学的単離のため、STX17ドミナントネガティブ変異体(GFP-STX17dNTR)のDOX誘導細胞(Uematsu et al., 2017, JBC)を用いてオートファゴソームを蓄積させ、OptiPrep密度勾配遠心によるフローテーションを行った。フローテーション後のトップフラクションにオートファゴソームが濃縮されていることを確認したので、ここからFLAGタグ(FLAG-LC3)による精製を行い、質量分析による外膜候補因子の同定を試みたが、オートファゴソーム-リソソーム融合に関わる因子は得られなかった。この原因として、精製オートファゴソーム画分に含まれるオートファゴソーム量が非常に少なく(GFP-STX17dNTRで蓄積させても絶対量が非常に少ない)、多段階の精製ステップを経ても他オルガネラの混入に埋もれてしまうためと考えられた。また、この方法ではオートファゴソーム外膜に局在する因子とオートファゴソーム内に局在する因子の区別がつかないため、別の方法として外膜因子の特異的ビオチン化(化学修飾)を行い、ストレプトアビジン磁気ビーズによる精製・濃縮を行った。特異的にビオチン化されたタンパク質の精製が確認されたため、現在質量分析による同定を進めている。さらに、同研究グループでのスクリーニングから、オートファゴソーム-リソソーム融合に関わる新規SNAREとしてYKT6が同定された。YKT6は既知のオートファゴソームSNAREであるSTX17とは別々に機能しており、オートファゴソーム-リソソーム融合には異なる2種類のSNAREシステムが使われていることが示唆された。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2017

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件)

  • [雑誌論文] Differential requirement for ATG2A domains for localization to autophagic membranes and lipid droplets2017

    • 著者名/発表者名
      Tamura Norito、Nishimura Taki、Sakamaki Yuriko、Koyama-Honda Ikuko、Yamamoto Hayashi、Mizushima Noboru
    • 雑誌名

      FEBS Letters

      巻: 591 ページ: 3819~3830

    • DOI

      10.1002/1873-3468.12901

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Accumulation of undegraded autophagosomes by expression of dominant-negative STX17 (syntaxin 17) mutants2017

    • 著者名/発表者名
      Uematsu Masaaki、Nishimura Taki、Sakamaki Yuriko、Yamamoto Hayashi、Mizushima Noboru
    • 雑誌名

      Autophagy

      巻: 13 ページ: 1452~1464

    • DOI

      10.1080/15548627.2017.1327940

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Autophagosome formation is initiated at phosphatidylinositol synthase‐enriched ER subdomains2017

    • 著者名/発表者名
      Nishimura Taki、Tamura Norito、Kono Nozomu、Shimanaka Yuta、Arai Hiroyuki、Yamamoto Hayashi、Mizushima Noboru
    • 雑誌名

      The EMBO Journal

      巻: 36 ページ: 1719~1735

    • DOI

      10.15252/embj.201695189

    • 査読あり

URL: 

公開日: 2018-12-17  

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