| 研究課題/領域番号 |
16K14728
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
金田 剛史 愛媛大学, 理工学研究科(理学系), 講師 (70301752)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞骨格 / 中間径フィラメント / 植物細胞 / 細胞周期 / タバコBY-2細胞 / シロイヌナズナ / 微小管 |
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| 研究実績の概要 |
中間径フィラメントは動物細胞において主要な細胞骨格の一種であるが、植物細胞においてその存在の有無は明確には証明されていない。本研究において、中間径フィラメントタンパク質とアミノ酸配列上に部分的な共通の特徴を持ち、形質転換タバコ細胞内でその遺伝子を発現させると細胞骨格様の線維を形成するシロイヌナズナのタンパク質をIFMoP1 (Intermediate filament motif protein 1) と命名し、植物の中間径フィラメントタンパク質の候補として解析を行なった。
細胞周期に関連したIFMoP1の細胞内局在の変化について、IFMoP1と蛍光タンパク質GFPとの融合タンパク質を作らせた形質転換タバコBY-2細胞において、DNA合成阻害剤aphidicolin及び微小管破壊剤propyzamideを用いた二段階法により細胞周期を同調化して調べたところ、IFMoP1-GFP蛍光は分裂期には紡錘体や隔膜形成体の近傍に見られた。また、IFMoP1-GFPが形成する細胞骨格様の線維は、分裂を終了した直後の細胞で比較的多く見られた。これらのことからIFMoP1が植物細胞内において細胞周期依存的な局在の変化を示すことが判った。
微小管を含む構造物（紡錘体、隔膜形成体）の近傍にIFMoP1が局在する様子が見られたため、間接蛍光抗体法により微小管を染色してその局在関係を調べたところ、IFMoP1は分裂期には紡錘体や隔膜形成体の微小管と共局在し、間期には微小管と独立した線維を形成するものと表層微小管の一部と共局在するものとがあることが判った。さらに、IFMoP1-GFPとｍCherry-TUBを発現させた細胞でIFMoP1と微小管の動態を観察し、IFMoP1が分裂期の間は微小管と共局在すること及び間期に形成されるIFMoP1の線維が核の移動に伴って動いていることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度に予定していた微細構造の観察等については進展がみられなかったが、平成29年度以降に予定していたIFMoP1の動態について、IFMoP1-GFPを発現させた形質転換タバコBY-2細胞を生きたまま観察する方法や細胞周期を同調化する方法により調べることができた。このことによりIFMoP1の細胞内局在の変化について、IFMoP1が線維を形成するのが細胞分裂直後の間期であることや、IFMoP1が細胞分裂中には線維を形成せず、微小管と共局在していることを明らかにし、予定を超える成果が得られた。
平成29年度以降に予定していたIFMoP1と微小管との局在関係について明らかにするための解析について、平成28年度中に固定した細胞を用いた間接蛍光抗体法による微小管の染色により共局在する様子を観察し、さらに、その動態についても蛍光タンパク質を用いた方法により部分的な解析を行なうことができた。これらの成果によって微小管との関連性についても示すことができた。
全体的に見れば順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度に成果が得られなかったIFMoP1が形成する線維の微細構造の解析を進める必要がある。また、平成28年度の成果としてIFMoP1と微小管が分裂期の細胞において共局在していることが強く示唆されたことから、今後はIFMoP1の機能を解明するために特に微小管と関連した機能について着目した解析が必要であると考えられる。そのためにIFMoP1欠損突然変異体の微小管の観察などを行う。IFMoP1が、微小管の他に、もう一つの主要な細胞骨格であるアクチンフィラメントとも関連しているか否かについても間接蛍光抗体法によるアクチンの染色や蛍光タンパク質を用いた解析により調べていきたい。
IFMoP1の細胞内局在の細胞周期依存的な変化についても調査を継続し、引き続き形質転換タバコBY-2細胞の生細胞を用いた動態観察により、IFMoP1が線維を形成する時期やIFMoP1と微小管との局在関係についてより詳細に調べ、植物細胞における中間径フィラメント様のタンパク質線維の働きを明らかにするための解析を行う。
また、シロイヌナズナの植物体においてプロモーターGUS解析により、IFMoP1が根端や茎頂付近などで発現することを確認しているが、RT-PCR法やin situ hybridization法により詳細に確認し、植物体のどこでIFMoP1が働いているのかについても明らかにする。
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