| 研究課題/領域番号 |
16K14739
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
佐藤 有紀 九州大学, 医学研究院, 准教授 (90508186)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | アクアポリン / 血管内皮細胞 / 内皮ー造血転換 / 二次造血 |
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| 研究実績の概要 |
血管内皮細胞と血球細胞は胚体外中胚葉の血島において共通前駆細胞から分化する。両者はやがて空間的に分離され、心臓の拍動開始と共に血球が血管内を循環する。血球・血管分化を制御する分子群は詳細になっているが、最初に出現する血液の「水分」がいつどのようにして適切に血管内へ取り込まれるのかは全くの謎である。本研究では胚発生初期の血管内への水分の流入機構を解明する為、水チャネル分子Aquaporin(AQP)に焦点を絞り、解析を行っている。
平成28年度までの研究から、AQP1が血管内皮から血球細胞へと分化する際の細胞形態の変化に関わる可能性が強く示唆された。平成29年度は、AQP1の発現時期と細胞形態変化の相関を直接的に確認するため、蛍光タンパク質融合型AQP1（AQP1-EYFP）を作製し、これを導入した血管内皮細胞のタイムラプス観察中にTet-onシステムによるAQP1-EYFPの発現誘導を行った。その結果、AQP1-EYFPの発現上昇に従って、血管内皮細胞が球形に変化することが判明した。生体内（ウズラ胚）においてもタイムラプス観察解析を行い、AQP1を強制発現させた血管内皮細胞が血球様細胞へ転換し、血流循環することを確認した。また、AQP1の発現制御に関わることが予想されている転写因子Klf2 cDNAを単離し、培養細胞および生体内においてAQP1と同様の内皮ー造血転換誘導作用を示すかどうかを調べた。その結果、Klf2もAQP1と同等の作用を持つことが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
初年度で見出した内皮ー造血転換へのAQP1の関わりを、AQP1発現誘導とタイムラプス観察解析とを組み合わせることで、より直接的に証明することができた。内皮ー造血転換時の細胞形態制御機構は、これまで積極的に調べられていない。本研究を通じて、血管はなぜ内皮形態を取り、血球はなぜ単一の浮遊形態をとるかについて細胞生物学的観点から細胞分化のしくみを解明できそうである。
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| 今後の研究の推進方策 |
AQP1を介した細胞内への水分流入が、細胞膜（体積や曲率）、細胞骨格（アクチンやミオシン）、細胞間接着（VE-カドヘリン）をどのように変化させ、造血幹細胞の出芽・遊離を起こすのかを詳細にする。これらの細胞構造をそれぞれ可視化するため、レンチウイルスベクターを用いてLyn-mRFP (細胞膜)、LifeAct-mRFP（アクチン）、 Myosin-mRFP、VE-cadherin-mRFPを恒常的に発現する血管内皮細胞株を作製する。これらの細胞株に対して、Tet-ONシステムを用いたAQP1-EYFPの発現誘導を行い、標識した分子群の挙動をタイムラプス観察解析する。これにより、水分子流入に対する細胞応答機序を明らかにする。また、AQP1の発現誘導によって人為的に血管内皮細胞から出芽・遊離させた血球様細胞が骨髄での成体型造血に寄与するのかを検証する。そのために、Tol2トランスポゾンを用いてAQP1発現細胞の長期追跡実験（細胞系譜解析）を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）年度末に開始した研究協力者（大学院生）の就職活動を優先させ、分子生物学的実験解析に関わる消耗品の購入を次年度に見送ったため。
（使用計画）主に分子生物学実験試薬の購入に充てる。
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