| 研究課題/領域番号 |
16K14762
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
村田 隆 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 准教授 (00242024)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | オプトジェネティクス / 植物細胞 / 微小管 / 遺伝子発現 |
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| 研究実績の概要 |
植物細胞においては、微小管は紡錘体の形成前にプレプロフェーズバンドと呼ばれる微小管の帯を作り、細胞表層に細胞質分裂シグナルを形成する。このシグナルに向かって細胞板をガイドするのも微小管と考えられている。本研究計画では細胞内の微小管ダイナミクスを光照射により局所的に制御する分子ツールを開発し、微小管構造の細胞内配置を改変することにより細胞分裂の方向を制御する。
28年度に微小管結合ドメイン(MBD)、光照射によりタンパク質結合を起こす配列(LovPep)、赤色蛍光タンパク質mCherryを連結したmCherry-MBD-LovPep発現タバコ培養細胞を作出し、この細胞にLovPepに結合するePDZとGFPを連結したePDZ-GFPを発現させたが、両者が高発現する細胞は少なく、期待する細胞形態変化は起きなかった。そこで、遺伝子サイレンシングが少なく、導入遺伝子を高発現するベクターの作製を進めた。mCherry-MBD-LovPep発現配列とのターミネーター重複を防ぐため、タバコ熱ショックタンパク質のターミネーターをクローニングして新規ベクターを作製したが、導入遺伝子のサイレンシングが顕著だった。そこで、アルコール脱水素酵素のターミネーターをクローニングした。また、新しいプロモーターの候補としてEF1αのゲノムDNAをクローニングした。これらを使ったベクター作製を進めている。
２光子スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いてタバコ細胞全周の微小管配列を調べた結果、細胞隅部の微小管安定化が細胞全域の微小管配列変化を誘導しないことを示唆する結果を得た。そこで、微小管の局所的切断用のDNA配列の作製を進めている。微小管切断タンパク質カタニンをコードするゲノムDNA（約10kb）のクローニングに成功した。これをタバコ細胞に導入するためのベクター作製を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究計画の前提となる、従来広く信じられていた細胞隅部での微小管安定化による細胞全域での微小管配列変化の仮説が誤っている可能性を見いだし、その検証に時間を要した。隅部の微小管安定化では細胞全域の微小管配列が変わらない可能性が高くなり、実験計画を見直した。また、これまで雇用していた技術支援員の雇用時間が減少し、新しいDNAコンストラクトの作成に予想以上の時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
隅部の微小管安定化では細胞全域の微小管配列が変わらない可能性については、それ自体が新発見なので論文化を目指してデータ解析を進める。現在、先端バイオイメージング支援プラットフォーム（ABiS）の支援により、細胞分裂直後の細胞全周の微小管配列の実測と、コンピュータシミュレーションを進めている。
一方、分裂面の制御については、２つの導入DNAを高発現するベクターの作製を進めることに加え、微小管切断因子カタニンを用いた局所的切断のためのDNA構築を進める。
支援員の作業時間については、人員増により改善される予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
技術支援員の雇用時間が減ったため未使用額が生じた。DNA配列解析の業者注文による費用や消耗品購入費用として使用する計画である。
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