| 研究課題/領域番号 |
16K14764
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
松田 学 筑波大学, 医学医療系, 講師 (30282726)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞分散 / RNA解析 / 酸性プロテアーゼ / ペプシン / 細胞培養 |
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| 研究実績の概要 |
組織に埋没しがちな特定の細胞種をトランスクリプトーム解析に資する状態で分取するための細胞分散法の技術開発が本研究の主な目標である。これには、差し当たって（1）細胞のRNAが分解しない細胞分散のため条件の最適化、（2）その条件で作用する最適なプロテアーゼの選定、（3）同条件でも細胞を選別できる分子マーカーの選定、（4）同分子マーカーを発現する組織の作成、（5）実際の組織からの特定細胞の分取、（6）同細胞のRNA解析による特定細胞の性質の評価の6つのステップに分けて、段階的に研究を進めることとした。このうち初年度は、主に（1）と（2）の作業に取り組む予定であったが、結果として、（1）および（3）の段階を進めることとなった。RNAの分解は細胞内のRNase活性に依存すると考えられるが、酵素ポリペプチド中の酸性アミノ酸側鎖カルボキシル基のpKa以下の酸性条件では、RNase活性が減弱することが、実験的にも確かめられた。しかし、同様の理由により、標識用タグとして期待していた蛍光タンパク質も酸性条件下では蛍光を著しく減弱させてしまうことも、実験的に確かめられた。この二律背反を乗り越える必要があったが、蛍光活性に重要な領域に酸性アミノ酸をもたないGFP変異体である蛍光タンパク質Siriusが、解決の糸口を与えてくれた。実用性の検証にはもう少し時間が必要だが、RNaseを抑えつつ蛍光検出するという技術的な問題はクリアしたと考えられる。今後は、効率よく細胞を分散させる酵素および反応条件の選定に注力することとなる。
なお、情報収集も兼ねて国際動物学会議に参加し、一部成果の発表を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度目標の第1段階、（1）内在性RNA分解酵素が作用しない条件域を見出す作業は概ね達成した。酵素処理を想定した条件下に乳腺培養細胞を置き、RNAの保存状態を調べた。その結果、pHの低下に従いRNAの分解が抑制され、pH2.5以下の条件では実用に耐える程度にまでRNA分解が抑えられることが示された。つぎに、第2段階である（2）酸性条件で細胞分散に作用する最適なプロテアーゼの選定過程は、予想された通り難航している。酸性条件下では負電荷を失ったタンパク質の凝集が起こり、ブタペプシンでは、実用に足る効率の良い細胞分散条件が見つけられなかった。現在、より酵素広い基質特異性をもつカビ由来の酸性プロテアーゼの適用が可能か、検討している。また、とくに間質の細胞外基質の主成分となるコラーゲンを分解する活性をもつ酵素のスクリーニングに向けて、ポリアクリルアミドゲル内コラゲナーゼアッセイ法の改良による新しい手法の開発に取り組んでいる。一方、（3）強い酸性条件でも利用できる細胞選別用分子マーカーの選定作業は、次年度の計画を前倒しして進展し、成果が得られた。検出のためのマーカーとして計画当初に考えていたオワンクラゲ由来の緑色蛍光色素タンパク質（GFP）は、RNA分解の起きにくい強い酸性条件下では蛍光を失い、同条件下で細胞分別を行うことが困難であることが判明した。そこで、酸性条件下でも蛍光活性を失わないGFP変異体であるSiriusの実用性を検討した。その結果、酸性条件下でも蛍光の減弱が限定的であり、pH2.5程度においても、発現量次第ではあるが細胞の分取に実用可能な蛍光強度が得られることがわかった。そこで、これも予定を前倒しして、（4）同分子マーカーを発現する組織標本を提供すべく、Siriusを特定の分化状態にある乳腺細胞が発現する遺伝子改変マウスの作成に着手している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度の主題は、初年度に引き続き計画の第2段階である（2）酸性条件で細胞分散に作用する最適なプロテアーゼの選定作業を進めることと、第4段階である（4）分子マーカーを発現する組織標本の準備、すなわち乳腺の一部の細胞でSiriusを発現するような遺伝子改変マウスの系統を樹立することである。まず、前者では、カビ由来の酸性プロテアーゼであるストレプトペプシンなどのリコンビナント酵素タンパク質を作成し、実用に足る細胞分散の条件がみつけられるか検討する。また、より広く材料を求める必要を生じた場合に備え、ゲル内コラゲナーゼアッセイ法を用いた新しいスクリーニング手法を完成させる。必要に応じてこの手法を利用して、酸性環境に生息する生物抽出液からの酵素の検出、さらには同定へと研究を展開させる予定である。一方、後者（4）については、Siriusの蛍光の弱さを考慮して、発現量の多いmoxd1とSiriusとの融合タンパク質をmoxd1プロモーターによる制御下で発現するような遺伝子改変マウスの樹立と選別を目指すことになる。これら2つのテーマで研究を進めることにより、次年度における検証実験へとつなげていきたい。また、年度の後半には乳腺泌乳研究会など国内集会への情報収集も兼ねた参加を予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
国際学会参加費用について格安の旅行プランを利用したことから、当初の見積よりも安く上がったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
酵素の選定作業がやや難航していることから、核酸の準備費用や組織培養にかかる出費が予想されるので、その不足分を補うための消耗品費として使用する予定である。
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