研究課題
生後の経験により神経回路の可塑性が高まる臨界期は、抑制性ニューロン（特にパルブアルブミン陽性PV細胞）の発達・成熟過程で起こる。臨界期のPV細胞発達に必須な転写因子であるホメオタンパク質Otx2について、これまでにChIP-seq法によりマウス臨界期皮質におけるターゲット遺伝子を明らかにした。トランスクリプトーム解析（RNA-seq）と併せた解析により、Otx2がPV細胞の発達とホメオスタシス制御に関わる遺伝子群を直接制御することが示唆された。一方で、Otx2は臨界期可塑性に関与する様々な遺伝子のプロモーターに結合するにも関わらず、通常の飼育条件下でOtx2機能欠損により有為に発現変動を示す遺伝子はごく一部に限られた。このことは、Otx2が臨界期に入力の変化があったときに可塑性関連因子の迅速な発現変化を可能にするよう、待機状態のクロマチン構造を作り出している可能性を示唆している。また、クロマチン高次構造を制御するコヒーシンについても、臨界期における機能解析を進めている。まず臨界期前後のコヒーシン各サブユニットの発現をRT-qPCRにより調べたところ、発達に伴い上昇する傾向が見られた。マウス視覚野の免疫染色から、コヒーシンは成体で報告されているように、臨界期でも皮質層全体にわたり神経細胞の核に局在していた。臨界期ニューロンゲノムにおけるコヒーシンの局在をChIP-seq法で調べるために条件検討を行い、ニューロン核からコヒーシンのChIP効率を上げる条件を見いだした。コヒーシンは生後の神経発達に関与することが示されており、今後臨界期におけるコヒーシンの詳細な解析を進めることにより、臨界期クロマチン制御、とりわけ抑制性ニューロンにおける遺伝子発現制御の一端が明らかになると期待される。
3: やや遅れている
生後の脳の細胞種特異的なクロマチン解析はその複雑さから方法論が確立されていない。さらに、精度の高い結果を得るためには視覚野に限定するなど少ない細胞数から解析を行う必要がある。これらを克服するため、今年度も細胞種ごとの分離方法、ニューロン核の単離方法に加えて、効率の良いChIPの条件について検討を重ねたことから、当初の計画よりも進捗が遅れた。しかし、これまでにNeuN（神経細胞特異的）核からのコヒーシンChIPの効率を上げる条件を見いだしており、今後網羅的解析を行う準備が着実に進んだ。
これまでに確立した系を用いて、臨界期前後の野生型正常マウスの大脳皮質から細胞種を分けてコヒーシンおよび修飾ヒストンのChIP-seq解析を行い、臨界期特異的なエンハンサーの同定およびコヒーシンによるクロマチン構造制御について知見を得る。さらに、コヒーシン関連因子のコンディショナルノックアウトマウスを用いて細胞種特異的にコヒーシンの機能を欠損させ、臨界期可塑性におけるコヒーシンの役割について電気生理学を用いた機能解析を行う。
実験手法の条件検討に時間を要したこと、および共通機器の不具合により当初の計画よりも進捗が遅れたため、物品費として主に計上していた次世代シークエンサー使用に掛かる金額を、次年度使用額として繰り越す。ChIP-seqの準備が整ったため、次世代シーケンサー使用の際の物品費として使用する予定である。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件)
Frontiers in Neuroscience
巻: 11 ページ: -
10.3389/fnins.2017.00307
Scientific Reports
巻: 7 ページ: -
10.1038/s41598-017-04007-x
