| 研究課題/領域番号 |
16K14797
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
大熊 盛也 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソースセンター, 室長 (10270597)
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| 研究分担者 |
野田 悟子 山梨大学, 総合研究部, 准教授 (80342830)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞内共生 / ゲノム動態 / 種分化 / 進化 |
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| 研究実績の概要 |
シロアリ腸内のセルロース分解性のEucomonympha属原生生物の細胞内共生スピロヘータ細菌のゲノム動態を解析するため、原生生物の１細胞内の複数の共生細菌のゲノム解読をめざす。このために、１細胞の原生生物をマイクロマニピュレータ装置によって分取して、セルソータ装置を用いて細胞内共生細菌をシングルセルに分離・分取することに成功した。４つの原生生物細胞からそれぞれ数細胞から十数細胞程度の細胞内共生細菌のシングルセルゲノム増幅産物を得て、16S rRNA遺伝子配列で確認後、ゲノム概要配列の解読に着手した。
また、細胞内共生スピロヘータ細菌の種分化を検討するため、オオシロアリ腸内の３種のEucomonympha属原生生物、ヤマトシロアリ等５種のシロアリ腸内から細胞内共生スピロヘータ細菌を有するTeranympha属の原生生物をそれぞれ１種ずつ、１細胞に分離・分取した。分取した１細胞を用いて全ゲノム増幅後に、原生生物と細胞内共生細菌のrRNA遺伝子配列に基づく分子系統を解析した。細胞内共生細菌は、16S rRNA遺伝子に加えてgyrB遺伝子配列もPCR産物のクローン解析に供した。１細胞の原生生物からは、ほぼ同一の共生細菌の遺伝子配列が得られ、原生生物１細胞に共生するスピロヘータ細菌がきわめて均一な系統からなる集団であることが明らかにされた。各シロアリ腸内に１種のみが生息すると考えられているTeranympha属原生生物の系統関係は、宿主シロアリの系統および細胞内共生細菌の系統関係と有意に一致しており、３者が共種分化してきたものであることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１細胞のEucomonympha属原生生物から細胞内共生スピロヘータ細菌細胞をシングルセルに分取することに成功し、全ゲノム増幅産物を確認して、ゲノム解析の準備が整った。解読ゲノム情報の詳細な解析までには至らなかったが、複数細胞の原生生物からそれぞれ複数の共生細菌のシングルセルゲノムDNAも準備することができ、ほぼ計画どおりに進めることができた。また、細胞内共生スピロヘータ細菌の原生生物１細胞内での系統多様性については、クローン解析でのレベルではあるが、これまで調べた限り、単一種からなることを明らかにできた。Teranympha属原生生物については、宿主シロアリも含めた３者間で共種分化の可能性を示すことができ、計画以上の成果となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
原生生物１細胞内の共生スピロヘータ細菌について、シングルセルで解読したゲノム配列情報を精査することで、原生生物１細胞内での共生細菌のゲノム動態や原生生物細胞間での共生細菌ゲノムの比較を行う。細胞内共生スピロヘータ細菌に近縁な細胞表層共生スピロヘータ細菌についても、シングルセルゲノム解析を進めており、それぞれゲノム上のトランスポゾン等の可動性因子を中心にゲノム動態について解析する。
細胞内共生スピロヘータ細菌の種分化について、現在、オオシロアリ腸内の複数種のEucomonympha属原生生物１細胞から共生細菌の遺伝子配列を取得・解析を実施している。Teranympha属とは異なり、１種のオオシロアリに少なくとも３種のEucomonympha属原生生物が共存しており、必ずしも共種分化した関係でない可能性を示す結果が得られつつあり、精査して細胞内共生細菌の種分化について考察をする。蛍光オリゴヌクレオチドプローブによるin situでの細胞内共生細菌細胞の検出も試みて、細胞形態や細胞内での局在・細胞数などの微生物生態学的データの取得も試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
原生生物１細胞内の共生スピロヘータ細菌のゲノム動態を解析するために、多数のシングルセルゲノムシーケンスが必要で、Miseqシーケンサーのようなショートリードを多数解析する方法を予定していた。シングルセルからのゲノム解析に、PacBioシーケンサーのようなリード数は少ないがロングリードでの解析が可能な方法が良いかの検討に時間がかかってしまった。今年度、複数の原生生物細胞から共生細菌のシングルセルからの全ゲノム増幅DNAを調整することができたので、次年度にゲノムシーケンスを実施する予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記理由に記したように、多数の細胞内共生スピロヘータ細菌のシングルセルゲノムシーケンスを実施する。シングルセルゲノム解析においては、微量のシングルセルゲノムの全ゲノム増幅DNAを解読するので、全ゲノム増幅初期段階で必ずしも相当に長いDNA断片が増幅されるとは限らず、PacBioでのロングリード解析の効果は限られたものである結果が得られている。一方で、ゲノム上に反復配列が多く、ゲノム配列アセンブリーが困難な場合には、Miseqシーケンサーでペアードエンドシーケンスに加えて、メイトペアシーケンスが有効と考えられ、これも合わせて実施することとしている。
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