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原核微生物の群集解析には、16S rRNA遺伝子による系統分類が広く使用されてきた。しかしながら、環境中に存在する微生物の多くは未培養微生物群を含むため、16S rRNA遺伝子に基づく系統分類では、その微生物が有する機能を理解することが困難な場合がある。一方、機能遺伝子に基づく多様性解析では、特定の機能を有する微生物群衆の多様性を明らかにできるが、その系統を推定することは困難である。そこで、本研究では、未培養微生物群の16S rRNA遺伝子と機能遺伝子を簡便かつハイスループッドに両者をリンクづけて解析する技術を創成することを目的とした。今年度は下記の実験を実施した。1)純粋微生物をDNAテンプレートとしてダイレクトPCRが可能かどうか確認を行ったところ、純粋微生物からのダイレクトPCRが可能であった。しかしながら、DNAテンプレートと比較するとPCR効率が低下することが分かった。2) 純粋微生物を用いて、マルチプレックスPCRを実施したところ、DNAテンプレートと同様の条件では16S rRNA遺伝子と機能遺伝子のマルチプレックスPCRが行えなかった。しかし、プライマー濃度を調整することで、純粋微生物細胞から2種類の遺伝子のマルチプレックスPCRが実施できることが判明した。したがって、微生物からのダイレクトPCRでは、プライマーの濃度設定が非常に重要なファクターであることが分かった。3) 純粋微生物細胞を用いて、16S rRNA遺伝子と機能遺伝子の結合PCRを実施した。その結果、双方の遺伝子が結合したと思われるサイズのDNAが生成されていることを電気泳動から確認した。また、16S rRNA遺伝子と機能遺伝子が結合した塩基配列でることも確認できた。
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