| 研究課題/領域番号 |
16K14846
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
池田 和生 山形大学, 農学部, 准教授 (80555269)
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| 研究分担者 |
村山 秀樹 山形大学, 農学部, 教授 (40230015)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | セイヨウナシ / 組織培養 / 果皮培養 / 赤着色 |
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| 研究実績の概要 |
前年度はセイヨウナシ果実の果皮培養の培養条件について，基本培地，オーキシン濃度，固化材の選択について検討を行った．本年度は再分化に影響が強いサイトカイニンの種類と濃度について検討を行った．実験の供試品種として，セイヨウナシ‘リーガル・レッド・コミス’および‘ロージー・レッド・バートレット’の幼果または果皮由来カルスを外植片とした．改変NN培地にナフタレン酢酸0.1 mg・L-1，ショ糖 3%，および固化剤としてゲランガム 0.4%を添加した．この培地に，ベンジルアミノプリンまたはチヂアズロンの濃度を変えたものを添加し，25℃暗黒下にて1ヶ月間，その後16時間日長にて培養を行い，毎月カルス形成率および果皮由来カルスからのシュート形成率を調査した．幼果皮を外植片とした場合，‘リーガル・レッド・コミス’については，サイトカイニンの種類および濃度差間における有意差はなく，カルス形成率が良好であった．‘ロージー・レッド・バートレット’については，ベンジルアミノプリンよりもチヂアズロン処理区で高いカルス形成率が得られた．果皮由来カルスを外植片とした場合，両品種ともベンジルアミノプリンより，チヂアズロン処理区にてカルス生存率が高く，チヂアズロン 5mg・L-1において，高いカルス生存率が得られた．よって，カルスを維持し続けるには，チヂアズロン5mg・L-1添加した培地での培養が好ましいと考えられた．しかしながら, 果皮由来カルスからのシュート形成には至らなかった．一方で，培養過程において赤く着色したカルスを得ることができ，これはL-1層由来の細胞から形成されたと推測される．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
セイヨウナシの組織培養は，幼葉やシュートの腋芽を外食片として，それらの部位から脱分化を経てシュートの再分化が可能であることがこれまでの研究で報告されている．本研究ではこれまで報告がなかったセイヨウナシ果皮細胞からの脱分化およびシュートの再分化を目的として培養条件の検討を行っている．これまでの成果でセイヨウナシの果皮培養には基本培地として窒素含量を減少した改変NN培地を用い，固化材としてゲランガム，オーキシンとしてナフタレン酢酸0.1mg・L-1を添加した培地が最も高効率でカルスの脱分化を促すことが明らかとなった．加えて今エンドの成果で，サイトカイニンはベンジルアミノプリンよりもチヂアズロンの方がカルス形成には適しており，その濃度は培養の段階，すなわち初期培養ではチヂアズロン1mg・L-1，その後のカルスの維持には5mg・L-1添加した培地が適しているとの結果を得た．これらの結果に関してはおおよそ順調に研究が進んでいるものと考えられる．一方でシュートの再分化が未だに確認されていない点については次年度の実験手法を修正する必要があると考えられる．また，果皮のL1層由来の細胞から脱分化したと考えられる赤く着色したカルスが得られたことから，これを更なる研究の材料として用い，分子生物学的手法やメタボローム解析を行い，発現遺伝子の特定や代謝産物の流れを明らかにすることも検討している．
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度はこれまで得られた果皮由来カルスから脱分化シュートの再生を試みる．セイヨウナシにおいて，カルスからのシュート再生は早い場合で1か月，遅い場合は1年以上かかるとされている．それを踏まえ，29年度までに得られたセイヨウナシ果皮からのカルス培養に適した培地条件で維持，継代培養を行い引き続きシュート再生を誘導する．また，上述の通り，再分化シュートを得るのに時間がかかるため，他の手法による個体形成も試みる．方法としては，現在継代培養中のカルスをホルモンフリー培地に置床し，暗黒化で培養することで不定根再生を誘導する．再生した不定根の先端部位の細胞を再度2,4,Dを含む不定胚形成培地に植え継ぎ不定胚を誘導し個体を得る方法の検討を行う予定である．
これまでの成果で得られた果皮由来カルスが赤く呈色するものと緑色のものが得られたことから，前述の培養とは別に当初の計画にはなかったが，これらのカルスを材料として分子生物学的アプローチから着色因子の特定を目指す．具体的には赤く呈色したカルスおよび白または緑色に呈したカルスからDNAを抽出し，次世代シーケンサーによるゲノムシークエンスを行い，得られたコンティグ同士の比較から変異領域の特定を行うことを計画している．
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