研究課題
予定していたリン代謝経路の改変による生物学的封じ込めの実証を初年度で終了することが出来たため、本年度は作製した大腸菌封じ込め株（RN1008)を用いて、亜リン酸輸送体HtxBCDの基質認識メカニズムの解明を試みた。当初予定していたアプローチのひとつに、輸送体の基質結合タンパク質(HtxB)の構造解析により、リン基質に対する特異性を解明することを計画していた。しかしながら、高濃度リン酸と亜リン酸の共存条件下に於いて、リン酸を利用できる変異株が得られ、さらにその変異点はHtxBではなく膜貫通ドメインに見出されたため、この変異株の解析によってメカニズムの解明を行うというアプローチに変更した。なお、このエスケープ変異株の出現頻度を調べた結果、10E-8以下であり、得られたエスケープ株の増殖は、著しく親株よりも劣っていた。従って、仮にエスケープ株が出現したとしても、他の株との共存下ではこのエスケープ株が支配的になる可能性は極めて低いと考えられる。膜貫通ドメインに見出された点変異を、site direct mutagenesisによりHtxBCD発現プラスミドに導入した結果、リン酸の輸送活性が認められた。従って、点変異によって置換されたアミノ酸がリン酸と亜リン酸の基質認識を行っている事が明らかとなった。さらに、このアミノ酸を他の19種類のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、亜リン酸特異性を維持できるもの、リン酸輸送能をもたらすもの、リン酸及び亜リン酸双方に対する活性を喪失するものの3種類に分類されることが明らかとなった。また、異なる微生物種への適用を想定し、HtxBCDタンパク質の発現を異種バクテリアで試みた。その結果、発現する宿主生物に応じてHtxタンパク質配列を改変することが重要である事が明らかとなった。
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Phosphorus Recovery and Recycling
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