| 研究課題/領域番号 |
16K14898
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
田中 俊之 筑波大学, 生命環境系, 教授 (10217052)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 酵素 / タンパク質発現 |
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| 研究実績の概要 |
放線菌由来の抗腫瘍性抗生物質ネオカルチノスタチン（NCS）の活性本体であるクロモフォアの９員環エンジイン骨格には炭素間三重結合が２つあり、その生合成には、１２種類の酵素が関与すると考えられている。今年度は、昨年度大量発現と精製法の確立に成功し、純度の高いタンパク質を得ることが出来た７種類の酵素に関して、構造解析に適した結晶を得るための予備検討を行った。また、発現量や安定性に問題のあったその他の酵素について、発現系の再構築を試みた。
昨年度一定量のタンパク質を発現することに成功したクレペニン酸の合成に関わる２種類の酵素に関して、大量発現と精製法の確立を試みた。しかし、純度の高いタンパク質を得るには至らなかったため、今後、発現系の構築も視野に入れ、再検討する予定である。
関東地方に生育する複数種の植物体から、新鮮な葉を採取した。採取後なるべく時間を置かず、Milli-Q水で洗浄した後に、適当な大きさに裁断し、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉末状にした。この粉末を材料とし、DNeasy Plant Mini Kitを用いてゲノムDNAを抽出した。次に、このゲノムDNAを用い、これまでにクローニングされている鎖状有機化合物炭素間三重結合の生成を触媒する酵素（アセチレナーゼ）のDNA配列に基づき設計したプライマー複数種を組み合わせてPCRを行った。得られたPCR産物から、TAクローニング等により、アセチレナーゼと推測される酵素をクローニングした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
今年度は、兼務している専攻長の業務量が更に増加し、研究に取り組む時間が取れなかったため、既に遅れている研究をほとんど進めることが出来なかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
純度の高いタンパク質を得ることが出来た環状エンジイン骨格合成酵素に焦点を絞り、三次元構造解析を進める。また、引き続き、国内で採取出来る植物や微生物を対象とした新奇アセチレナーゼの探索を続ける。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「現在までの進捗状況」にも記載したが、専攻長業務の負担が大きく、当初の予定から遅れている研究にほとんど取り組むことが出来なかったため、次年度使用額が生じた。
環状エンジイン骨格合成酵素の結晶化のための消耗品類を購入する。また、その他のアセチレナーゼについては、大量発現系と効率良い精製方法の確立に必要な消耗品や実験器具類を購入する予定である。
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