| 研究課題/領域番号 |
16K14916
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
国吉 久人 広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (60335643)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ミズクラゲ / 変態 / インドール酢酸 / 生合成 |
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| 研究実績の概要 |
ミズクラゲ幼生体内に存在するIndole-3-acetic acid (IAA)関連物質を分析するため、LC-MS/MSを用いた定量系の確立を試みた。広島大学共通機器のACQUITY UPLC-TQD (Waters)を使用して、IAAとTryptamine (TAM)の合成標品について測定系を検討した結果、親イオンおよびフラグメントイオンの検出に成功し、定量系確立の目途を立てた。
これまでに得られたミズクラゲIAA生合成酵素群の候補遺伝子のうち、ミズクラゲにおけるAromatic L-amino acid decarboxylase (AADC)の相同遺伝子と考えていた２種の遺伝子(Unigene8596、Unigene12993)と、他の動物に存在する同族の遺伝子群との間で詳細に分子系統解析を行った結果、いずれもAADCでない可能性が高いことが判明した。現在までに、これら以外のAADC相同遺伝子が見つかっていないので、解析の対象をMonoamine oxidase (MAO)およびAldehyde dehydrogenase (ALDH)に絞ることとした。
MAOとALDHの発現細胞を特定するために、whole-mount in situ hybridization法による組織染色を試みた。定法に従い、DIGラベルした一本鎖DNAプローブを調製して、whole-mount固定したポリプおよびストロビラを染色したが、バックグラウンドのシグナルが高く、特異的な染色結果が得られなかった。一方、切片標本に対するin situ hybridization法を視野に入れて、ポリプおよびストロビラを固定した後にパラフィン包埋し、切片を作成した。これまでにHE染色、活性染色、抗体染色などを行い、良好な結果が得られている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究実施計画で予定していたLC-MS/MSを用いたIAA関連物質の定量系について、合成標品を用いた実験ではほぼ確立できている。
IAA生合成酵素群の酵素活性を確認するために、組換えタンパク質の調製を進めている。いくつかの遺伝子について、大腸菌用発現ベクターpET32に各酵素遺伝子のORF領域を組み込んだプラスミドを構築した。
IAA生合成酵素群の発現細胞を特定するため、whole-mount in situ hybridization法による組織染色を試みたが、特異的な染色結果が得られなかった。whole-mount染色は困難であると考え、切片標本のin situ hybridization法に方針を切り替えた。これまでのところ、ポリプおよびストロビラの固定・パラフィン包埋・切片作成法を確立し、HE染色、活性染色、抗体染色などで良好な結果が得られている。
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| 今後の研究の推進方策 |
【Exp.1】「LC-MS/MSを用いたIAA関連物質の分析」については、LC-MS/MSを用いたIAAとTAMの分析系をほぼ確立できている。今後は、この分析系を用いて、ポリプおよびストロビラの抽出物中のIAA関連物質を定量したい。
【Exp.2】「IAA生合成酵素群の酵素活性測定」については、現在構築中のプラスミドベクターを大腸菌に導入し、組換えタンパク質を調製した後、酵素活性測定を試みる。
【Exp.3】「IAA生合成酵素群の発現解析」については、ポリプ・ストロビラの切片を作成し、in situ hybridizationを試みる。また、【Exp.4】「ポリプ化活性物質TAMの曝露実験」については、TAMの投与条件(濃度、投与時期など)を検討した後、曝露実験に取りかかりたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2018年度中の計画に含まれていた【Exp.1】「LC-MS/MSを用いたIAA関連物質(TAM, IAAなど)の分析」については、予備実験で良好な結果が得られたものの、内在性IAA関連物質の定量に至っていない。2019年度では、内在性IAA関連物質の定量を行う予定であり、その分の必要経費を繰り越した。【Exp.2】「IAA生合成酵素群の酵素活性測定」については、ベクター構築に時間がかかったため、組換えタンパク調製のための必要経費分は未使用のままである。同じく、【Exp.4】「ポリプ化活性物質TAMの曝露実験」の必要経費分も未使用のままであるため、2019年度に繰り越した。
【Exp.1】「LC-MS/MSを用いたIAA関連物質の分析」については、消耗品、試薬類の経費として使用する。【Exp.2】「IAA生合成酵素群の酵素活性測定」については、大腸菌発現用の培地、消耗品、試薬類の経費として使用する。【Exp.3】「IAA生合成酵素群の発現解析」については、in situ hybridizationに用いる消耗品、試薬類の経費として使用する。それに加えて、【Exp.4】「ポリプ化活性物質TAMの曝露実験」のための飼育用器具類・飼料、消耗品、試薬類の経費として使用する。
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