| 研究課題/領域番号 |
16K14962
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
山口 晴生 高知大学, 教育研究部自然科学系農学部門, 准教授 (10432816)
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| 研究分担者 |
西脇 永敏 高知工科大学, 環境理工学群, 教授 (30237763)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 海洋 / 物質循環 / リン酸 / 還元 / 酸化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，海水中に含まれる各種リンの定量的検出系を確立し，それを用いて未だ知られていないリン酸還元現象を明らかにすることに挑む。本年度は，核磁気共鳴（NMR）によるリン検出の諸条件最適化に取り組み，内部標準化合物を選抜導入することで，従来までの無機リン酸のみならずC-P，C-O-P，N-P結合を有するリン化合物の定量が可能となった。海水中にはNMRを阻害する常磁性元素などの物質が含まれているため，これらを強力に除去し，リン化合物を抽出する必要がある。しかし従来法では，その抽出過程でリン化合物の変性をともなう可能性が指摘されており，海水中に含まれる様々な形態のリン化合物を検出することは困難とされてきた。本研究で構築した方法であれば，常磁性元素を豊富に大量に含む海水培地であっても各種リンの正確な検出が可能であり，さらに安定性の高い既知濃度の内部標準化合物を用いることで，定量性も確保することができた。
このNMRベースの方法を用いることで，海洋微生物の各種リンの利用を解明することができた。すなわち試験した多くの海洋微生物（特に真核微生物）はリンの還元能を有していない。これらは酸化型のリンを積極的に利用しながらも，それらを還元することはない。この過程で，試験したいくつかの微生物は酸化型のリンを優先的に利用するものの，還元型のリンをも利用可能である。これらの微生物は海洋に広く分布する細菌群であり，種を特定するに至っている。この利用プロセスにリンの酸化・還元が関わる可能性ついては検討中であり，とりわけ後者を行う微生物については探索中である。
今回得られた成果は，海洋におけるリン組成の解明ならびにおいて重要な知見になると期待される。これらの成果の一部は，国際シンポジウムにて発表しており，今後の実績基盤として位置付けられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の最大の目的はリン酸還元を行う微生物の探索にある。目的の生物を効率よく見出すために，まず海底泥における各種リンの分布・組成を明らかにし，還元型リンが豊富に含まれる試料を得る。それを各種条件で培養し，酸化・還元型リンの変動を調べることで，リンの還元ポテンシャルを有する微生物集積試料を調製，そこから目的生物を分離することを本年度の目的としている。
１）各種リンの分布・組成
現在までに，春季から冬季にかけて高知県浦ノ内湾の底泥を採取し，そこに含まれる各種リンの分布・組成を解析してきた。しかしながら，核磁気共鳴（NMR）を阻害する物質を完全に除去することが困難なため解析が難航している。
２）海洋微生物による各種リンの利用
前年度に確立した各種リン化合物の網羅的・定量的検出系により海洋微生物によるリンの利用が部分的に明らかとなった。少なくとも本研究で行った培養試験の結果をみる限り，海洋真核微生物が正リン酸を還元することはなく，また還元型リンも酸化等を経て利用することはない。一方，海洋原核生物である細菌のなかには，嫌気環境下においてリン還元を行うものが存在しうる可能性を抽出した。電子受容体として正リン酸のみが存在する培地にて細菌の増殖を見出せたことから，おそらくリン酸還元ポテンシャルを有しているものと推察される。現在までにそれらの集積培養を安定化できた段階にある。しかしながら，その試料を同組成の寒天培地に接種しても細菌などの微生物コロニーが得られず，純粋株の分離には至っていない。
以上を踏まえ，当初の計画に比べて研究の進捗はやや遅れていると言わざるを得ない。この状況に鑑み，今後の研究をより合理的に推進可能な方策を立案・実施することで，研究の目的達成を図る。
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| 今後の研究の推進方策 |
正リン酸の還元ポテンシャルを有する微生物群の探索に重点的に取り組む。この達成に向けて，研究を合理的に推進する方策を以下のように考えている。
１）各種リンの定量的検出法
現在まで，核磁気共鳴（NMR）をベースにした方法であれば，培養試料中の各種リンの定量的・網羅的解析が可能であることを示してきた。しかし海底の泥に含まれる各種リンについては正確に検出することができていない。この状況を打破し，リン酸還元ポテンシャルを評価するためには，NMRの阻害物質をより強力に除去する方法を考える必要がある。そこで今後は，様々なキレーターのNMR阻害軽減効果を検証していく。また，NMR阻害の改善が困難な場合を想定し，新たなリン検出技術の構築を図る。予備的に検討を重ねてきた酸化処理法により還元型リン酸を正リン酸に完全酸化可能な方法を構築する。その上で，正リン酸の一般定量法とプレートリーダーを組み合わせるにより，海水中の還元型リン酸を高速定量可能なことを示す。これらの系を実験に導入できれば，正リン酸と還元型リンの挙動を効率よく調べることができるため，研究計画を強力に推進できるものと期待される。
２）リン酸還元を行う細菌の分離
現在まで集積培養している細菌試料のうち，正リン酸の還元ポテンシャルを有する試料が見つかっている。当該試料より目的とするリン酸還元細菌を分離するにあたっては，分離の大幅な効率化を図る。ここでは集積培養で得られた試料を表面凸凹寒天培地（山口ら 藻類2016）に塗抹し，細菌のコロニー形成（形成可能種の拡大）を促進する。この培地にはマイクロレベルの凹部が設けられているため，一般に用いられる“固相”寒天培地とは“液相”画分を有する点で大きく異なる。この液相凹部で微生物を増殖させることで，固相の乾燥ストレス等に耐えられない（増えることができない）細菌等の微生物を効率よく培養できることが期待される。
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