| 研究課題/領域番号 |
16K14980
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
鈴木 徹 東北大学, 農学研究科, 教授 (70344330)
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| 研究分担者 |
宇治 督 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 主任研究員 (40372049)
横井 勇人 東北大学, 農学研究科, 助教 (40569729)
木下 政人 京都大学, 農学研究科, 助教 (60263125)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 水産増養殖 / ゲノム編集 / 遺伝子導入 / 腹腔内注射 |
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| 研究実績の概要 |
CRISPR/Cas9法は、水産増養殖の分野にも応用され始めている。魚類でのゲノム編集は、顕微注入で行うのが一般的であるが、熟練した技術が必要であり、海産魚の場合、注射後に海水からイオンが流入することで受精卵の生残率が悪いなどの問題がある。本研究では、雌親魚の卵巣内卵母細胞にゲノム編集関連試薬を導入して、効率的にゲノム編集を行うことを目的としている。
魚類では、肝臓から分泌された卵黄タンパク質(Vg）は細胞膜Vg受容体を介して卵母細胞に取り込まれ、この際にVg配列内にあるHLTKTKDL(Vgキャリアペプチド)が受容体と結合する。昨年度、合成Vgキャリアペプチドが卵母細胞に取り込まれることを発見したので、本年度はこれを媒介としてCRISPR-Cas9を卵母細胞に導入する方法を検討した。まず蛍光で検出可能なGFPをモデルタンパク質とし、GFPにVgキャリアペプチド、HiBiT tag (ルシフェラーゼ断片と結合するペプチドタグ)、核移行シグナル（NLS）、His tagを連結したキメラタンパク質を合成し、雌ゼブラフィッシュに腹腔内注射したところ、卵巣内卵母細胞および受精卵からGFP蛍光が検出され、Vgキャリアペプチドを利用して卵母細胞にタンパク質を導入する技術が開発できた。次にVgキャリアペプチドを結合したCas9ヌクレアーゼを合成したが、DNA切断活性を示さなかった。
初年度は、CRISPR/Cas9ベクターをエレクトロポレーションで卵母細胞に導入することを試みたが、濾法細胞が障壁となって卵母細胞には導入できないことが分かった。2年度と最終年度の結果により、Vgキャリアペプチドを媒介にしてCas9ヌクレアーゼを含むタンパク質を導入する方法が確立され、あと少し工夫することで「卵巣内卵母細胞にゲノム編集関連試薬を導入して、効率的にゲノム編集を行う」ことが可能となると期待する。
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