| 研究課題/領域番号 |
16K15023
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
松田 二子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (10608855)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 獣医学 / 畜産学 / 応用動物 / 細胞・組織 |
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| 研究実績の概要 |
哺乳類が一度に排卵する卵母細胞の数は種によって決まっており、厳密なコントロールがなされているが、その制御機構は未だ解明されていない。本研究成果を応用し排卵数を任意に調節できるようになれば、ウシの双胎回避、ブタの生産効率向上、家畜およびヒトの卵巣疾患治療などへの応用が可能となり、獣医畜産・医療分野へ大きく貢献する。
本研究では、ウシ卵巣の顆粒層細胞を用いて排卵数を支配的に制御する卵巣内因子を探索している。昨年度に次世代シーケンサーによる発現遺伝子のトランスクリプトーム解析（RNA-seq）を実施し、成熟雌ウシの主席卵胞と次席卵胞の顆粒層細胞で有意に発現量に差がある500以上の遺伝子のリストを得た。このリストの中にはこれまでに顆粒層細胞で重要な役割を持つことが報告されている遺伝子が多数含まれていたことから、信頼できるデータを得ることに成功したと考えられる。リスト中から、発現量の多さ、主席卵胞と次席卵胞での発現量比の大きさ、これまで卵巣における機能が不明であること等を基準に、今後詳細な機能解析を行う排卵数決定候補遺伝子として10個程度を選んだ。次に、RNA-seq解析の結果を確認するための実験を行った。RNA-seq解析に用いた残りのRNAからcDNAを合成し、RT-PCRにて候補遺伝子の発現量を解析した結果、主席卵胞と次席卵胞の顆粒層細胞でRNA-seqと同様の発現パターンが得られた。候補遺伝子の局在と発現量を確認するため、ウシ卵巣でのin situ hybridizationを実施する予定であり、複数個の遺伝子についてprobeの作製を完了した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ウシ顆粒層細胞のトランスクリプトーム解析を実施し、主席卵胞と次席卵胞で発現量が有意に異なる遺伝子を多数特定できた。これらの遺伝子の中には過去の報告と一致するものも多数含まれ、信頼できる解析結果を得られたことが強く示唆された。これらの中から排卵数決定候補遺伝子を絞り込み、別の手法（RT-PCR）にてトランスクリプトーム解析と同様の結果が出るところまで確認できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
新たにウシ卵巣凍結ブロックを採取する。また、ウシ卵巣から顆粒層細胞および卵胞液を採取し、顆粒層細胞からはRNAとタンパク質の抽出を行う。ウシ顆粒層細胞のトランスクリプトーム解析で得たデータから選んだ排卵数決定候補遺伝子について、発現量・局在をreal-time RT-PCR、Western blotting、 in situ hybridization、免疫組織化学にて確認する。候補遺伝子のうち分泌型のものについては、ウシ卵胞液を用いてenzyme immunoassayを行い主席卵胞と次席卵胞で量に違いがあるかを確認する。主席卵胞と次席卵胞で発現量に違いが確認できた候補遺伝子について、初代培養顆粒層細胞を用いた機能解析を実施する。候補遺伝子がin vivoにて排卵数に影響しているかを確認するため、実験動物（マウス、ラット、ヤギ等）の生体を用いた解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）ヤギを用いた実験を計画していたが、ウシでの良好な解析結果が得られたためそちらを優先して進めた結果、ヤギの実験に関する予算の使用が予定より抑えられた。
（使用計画）ウシ卵巣サンプリングをする際の旅費、in vivoでの解析に必要なヤギ、マウス、ラットの購入および飼育費用、enzume immunoassayの購入費用等に使用する計画である。
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