| 研究課題/領域番号 |
16K15069
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
手林 慎一 高知大学, 教育研究部自然科学系農学部門, 准教授 (70325405)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | イネ / アブラムシ / アミノ酸 / エリシター |
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| 研究実績の概要 |
オカボノアカアブラムシがイネの根に寄生すると、「何らかの刺激」により寄生部位の遺伝子発現が大きく変動し、結果としてアスパラギンやグルタミンなど一部のアミノ酸が高濃度に蓄積することを見出した。この特異に富栄養化したアミノ酸組成は、アブラムシが共生菌ブフネラからアミノ酸の供与を受けるために最適化されており、アブラムシが自己の増殖のために植物の栄養状態を改変していることが示され、その調節機構の解明が待ち望まれている。本研究ではこのアミノ酸生合成経路の遺伝子発現を活性化する「分子レベルの刺激（エリシター）」を解明し、食害者にとって利益をもたらすという全く新たなカテゴリーのエリシターの存在を証明することを目的とした。現在までに1000頭程度のアブラムシの懸濁液をイネ幼苗の根（傷害処理済み）に処理することでアミノ酸蓄積誘導の再現に成功している。しかし本法では傷害の程度により誘導活性が影響することや、生物試験に必要なアブラムシ量が多量であることが研究進展の妨げとなっていた。そのために本年度は安定的なエリシターの活性評価方法の開発を目指した。
詳細なメタボローム解析の結果からターゲットとなるアミノ酸類の代謝関連化合物であるセロトニンが同時に蓄積することが確認され、セロトニンを指標としたエリシターの活性評価方法の開発が可能であるもの考えられた。そこでまず各種人工エリシター処理によるセロトニンの誘導蓄積の可否を検討したところ、アブシジン酸やサリチル酸の処理によるセロトニン蓄積が確認された。そこでこの処理技術の小規模化に取り組み現在までのところ２mm程度のイネ根に対するエリシター処理によるセロトニン誘導蓄積が可能と見積もられ、安定的なエリシターの活性評価方法開発に道を開いた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究ではアブラムシがイネ根に寄生した際に生じるアミノ酸生合成経路の遺伝子発現を活性化する「分子レベルの刺激（エリシター）」の解明を目的としており、本年度は安定的なエリシターの活性評価方法の開発を行った。
ターゲットとなるアミノ酸およびその代謝関連化合物の動態をメタボローム解析により解析したところ、複数のアミノ酸とその代謝産物がアブラムシの寄生により蓄積することが判明した。とくにトリプトファンの代謝産物であるセロトニンが寄生３日後には有意に増加することを確認した。セロトニンはHPLCによる微量分析が可能であることから、これを指標としたエリシターの活性評価方法の開発が容易であると考えられた。
そこでこの成果をもとにセロトニン誘導蓄積をターゲットとしたエリシター処理方法の開発を試みた。即ち、播種５日目のイネの根に各種の人工エリシター（アブシジン酸、インドール酢酸、サリチル酸、ジャスモン酸、塩化銅、キトオリゴ糖）溶液を処理し、イネ根をメタノールで抽出後にHPLCで分析することでセロトニンの蓄積量を確認したところ、アブシジン酸やサリチル酸の処理によってセロトニンの蓄積誘導が確認された。そこでこの処理技術をより小規模化するために、アブシジン酸処理におけるイネ根断片の状態（カーボランダムによる傷害、チョッピング、２分割など）についての検討を行った。その結果、傷害程度が大きいほどセロトニンの蓄積誘導が大きいことが判明したが、ばらつきも多いことが合わせて見出された。
以上のようにエリシターの活性評価方法の改善に目途が立ったため本研究は概ね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究ではアブラムシがイネ根に寄生した際に生じるアミノ酸生合成経路の遺伝子発現を活性化する「分子レベルの刺激（エリシター）」を解明するために、まず安定的なエリシターの活性評価方法の開発を達成する。これに引き続き、確立した活性評価方法をもとにエリシターの精製・特性解析を行う。具体的には以下の方法で実施する。
生物試料調整にために人工気象器にて均一なイネ幼苗（日本晴）を栽培し、生物試験に供試するとともに、オカボノアカアブラムシの飼育に供試する。大量飼育されたオカボノアカアブラムシは使用するまで－20℃で保存する。
エリシターの活性評価方法開発のために、処理するイネ根断片の状態（チョッピングサイズの決定）の検討を行うとともに、処理時間（24-72時間）を検討し、最終的な生物試験方法を確立し、エリシターの精製・特性解析に資する。
精製は予備試験の結果を参考に、液-液分配分画の水画分を、逆相系カラムクロマトグラフで水によって溶出された画分をさらに精製する。具体的な精製方法は試行錯誤的に選択されるが、ゲル濾過カラムまたは透析（或はその両方）にて粗精製を行った後に、HPLCを中心とした複数種のクロマトグラフィーを有機的に組み合せた分離システムを確立させ精製を遂行する予定である。
最終的には単離されたエリシターの構造を赤外吸収、紫外吸収、質量分析、核磁気共鳴等の各種スペクトルを測定することで決定する。必要に応じて合成的手法を用いて推定構造の確認や、誘導体化等による結晶化後のＸ線構造解析をも予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究ではアブラムシがイネ根に寄生した際に生じるアミノ酸生合成経路の遺伝子発現を活性化する「分子レベルの刺激（エリシター）」を解明するために、現在までに1000頭程度のアブラムシの懸濁液をイネ幼苗の根（傷害処理済み）に処理することでアミノ酸蓄積誘導の再現に成功している。しかし本法では傷害の程度により誘導活性が影響することや、生物試験に必要なアブラムシ量が多量であることが研究進展の妨げとなっていた。そのために本年度は安定的なエリシターの活性評価方法の開発を目指したため、予定していた分子生物学試薬の購入量が減少したため次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
新たな確立された安定的なエリシターの活性評価方法ではHPLCによるアミノ酸代謝産物分析を行うため、これに必要なHPLCカラムや分析用の試薬、前処理資材の購入に活用する。また、エリシターの活性評価方法の改善により対象現象に違いが生じている可能性がある。そこで両方のエリシターの活性評価方法によるイネ根における生理変化を確認するためメタボローム解析とトランスクリプトーム解析の経費に活用する。予定である。
これらはいずれも本研究の遂行に必要な経費である。
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