ヒト樹状細胞の生理的役割を解明する変異型IgE受容体設計と遺伝子改変マウス作出

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K15092
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 西山 千春 東京理科大学, 基礎工学部生物工学科, 教授 (20327836)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: IgE受容体 / 樹状細胞 / IgE抗体 / マスト細胞 / 好塩基球

研究実績の概要

IgEは花粉症などのアレルギー反応を引き起こす抗体であり、高親和性IgE受容体（FcεRI）を介してエフェクター細胞を活性化する。FcεRIは、ヒト、マウス共にマスト細胞と好塩基球の表面に発現するが、加えて、ヒトの場合には樹状細胞にも恒常的に高レベルに発現している。FcεRIはα、β、γの3種類のサブユニットより構成されており、これら分子の発現特異性とタンパク質構造特性により、マウスの樹状細胞はFcεRIを発現しない。そこで、IgE抗体が樹状細胞を介して及ぼす生体内の免疫応答を解析するために、ヒトαのようにγとの相互作用のみで樹状細胞上に発現し、かつ野生型マウスαと同程度に強くマウスIgEと結合できる変異型αの構築を目指した。
まず、αの一次アミノ酸配列をヒトとマウス間で比較し、ヒトαの立体構造情報を基に、IgE抗体のFc領域と直接結合するアミノ酸残基のうち、ヒトとマウスで異なる4アミノ酸残基を選定した。続いて、ヒトαのcDNAをクローニングし、4つのアミノ酸残基を単独、あるいは複数組み合わせてマウス型アミノ酸残基へ置換するため変異導入を施した変異体の発現ベクターを構築した。これらをマウスγ発現ベクターと共に、非血球系細胞株Plat-Eに一過性導入し解析した結果、いずれの変異体も細胞表面に発現することが確認された。IgE抗体の結合強度は、4アミノ酸残基全てをマウス型に置換した変異体で最も強く、マウス野生型αとほぼ同等であった。さらに、マウス骨髄細胞より分化誘導して調製した樹状細胞にウィルスベクターを用いてα変異体を発現させたところ、いずれの変異体も他の分子の共発現なしに細胞表面に発現していた。
これらのことから、目的であったマウス樹状細胞表面に発現し、かつマウスIgE抗体と自然な強度で結合するα変異体が得られたと示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ほぼ目指す特性を持ったα変異体を得ることができた。
また、α変異体を発現させるウィルスベクター系が構築できており、恒常的にα変異体を発現するプライマリー樹状細胞を調製する体制ができている。これを用いることによって、in vitroでの樹状細胞機能解析を随時行うことができると同時に、α変異体発現樹状細胞をマウスに移植する実験によって遺伝子改変マウスの作出と同時進行でin vivo解析を進めることができる。
遺伝子改変マウスの作製については、α変異体のcDNAをノックインマウスやトランスジェニックマウス作製のためのベクターへ挿入して用いることができるため、速やかに着手できる。

今後の研究の推進方策

IgE抗体の結合活性がマウス野生型αとほぼ同等の変異体が得られているが、異なるマウスIgEクローンについての検討や濃度依存性の解析など、さまざまな条件下で確認し、構造-機能相関を考察できる定量データを蓄積する。解析の結果、より強い活性が必要と判断された場合には他の候補アミノ酸残基を選定し変異導入を加えていく。十分に高活性なαであると判断され次第、レトロウィルスベクター系を用いてマウス骨髄由来樹状細胞へα変異体を強制発現させ、抗原とIgE抗体に応答した細胞機能を解析する。具体的には、受容体を介した抗原取り込み能やT細胞活性化能、樹状細胞自身のサイトカイン産生や共刺激分子発現を評価する。
同時に、α変異体cDNAをRosaローカスに挿入するためのベクター構築を行い、プラスミドが得られ次第ノックインマウスを作製する。このマウスをCD11cプロモーター制御下にCre酵素を発現するマウスと交配することによって、CD11c陽性細胞（樹状細胞）特異的にα変異体を発現するマウスを得る。
IgE抗体依存的な生体応答が関わるアレルギーモデルを用いて、本マウスの生体内で樹状細胞が及ぼす作用を明らかにする。
ノックインマウスの作製に時間を要する可能性が考えられるが、対応策として、野生型の骨髄由来培養樹状細胞にレトロウィルスベクターを用いてα変異体を恒常的に発現する樹状細胞を調製し、これをマウスに移植して生体内免疫応答を解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Role of PU.1 expression as an inflammatory marker in experimental autoimmune uveoretinitis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Umazume, A., Kezuka, T., Matsuda, R., Usui, Y., Takahashi, H., Yamakawa, N., Yashiro, T., Nishiyama, C., and Goto, H.
  • 雑誌名: Ocular Immunology and Inflammation 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] The hematopoietic cell-specific transcription factor PU.1 is critical for expression of CD11c. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yashiro, T., Kasakura, K., Oda, Y., Kitamura, N., Inoue, A., Nakamura, S., Yokoyama, H., Fukuyama, K., Hara, M., Ogawa, H., Okumura, K., Nishiyama, M., and Nishiyama, C.
  • 雑誌名: Int. Immunol. 巻: 29 ページ: 87-94
  • DOI: 10.1093/intimm/dxx009.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Pharmacological inhibition of Notch signaling suppresses food antigen-induced mucosal mast cell hyperplasia. (2017)
  • 著者名/発表者名: Honjo, A., Nakano, N., Yamazaki, S., Hara, M., Uchida, K., Kitaura, J., Nishiyama, C., Yagita, H., Ohtsuka, Y., Ogawa. H., Okumura, K., and Shimizu, T.
  • 雑誌名: J. Allergy Clin. Immunol. 巻: 139 ページ: 987-996
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2016.05.046.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Critical role of transcription factor PU.1 in the function of the OX40L/TNFSF4 promoter in dendritic cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yashiro, T., Hara, M., Ogawa, H., Okumura, K., and Nishiyama, C.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 6 ページ: 34825
  • DOI: 10.1038/srep34825.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Role of PU.1 in MHC class II expression via CIITA transcription in plasmacytoid dendritic cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Miura, R., Kasakura, K., Nakano, N., Hara, M., Maeda, K., Okumura, K., Ogawa, H., Yashiro, T., and Nishiyama, C.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 11 ページ: e0154094
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0154094.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] 転写因子PU.1のアレルギー疾患治療標的としての有効性 (2017)
  • 著者名/発表者名: 小田祥人、笠倉和巳、八代拓也、西山千春
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] 新規アミノ酸DADHによるマスト細胞活性抑制 (2017)
  • 著者名/発表者名: 白井智丈、笠倉和巳、長谷部文人、松田研一、八代拓也、西山真、西山千春
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] 新規非タンパク性アミノ酸DADHによる免疫抑制作用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 関本崇宏、八代拓也、長谷部文人、松田研一、笠倉和巳、西山真、西山千春
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] マスト細胞活性化反応に対する短鎖脂肪酸の抑制効果 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤垣泉、笠倉和巳、八代拓也、西山千春
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] Notchシグナルによってマスト細胞が獲得する抗原提示様の形質 (2017)
  • 著者名/発表者名: 中野信浩、西山千春、奥村康、小川秀興
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] GATA2によるマスト細胞プロテアーゼの発現制御機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 笠倉和巳、中谷光、新井貴大、八代拓也、西山千春
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] The nuclear orphan receptor NR4a3/NOR1 is involved in the function of dendritic cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yashiro, T., Kasakura, K., Nishiyama, C.
  • 学会等名: The 45th Annual Meeting of The Japanese Society for Immunology
  • 発表場所: 沖縄
  • 年月日: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [学会発表] GATA2 is involved in the expression of the decoy receptor for IL-33 by binding to the proximal promoter with chromosomal loop formation. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kasakura, K., Yashiro, T., Hara, M., Okumura, K., Nishiyama, C.
  • 学会等名: The 45th Annual Meeting of The Japanese Society for Immunology
  • 発表場所: 沖縄
  • 年月日: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [学会発表] Transcription factor Tlx1 regulates the ability of spleen mechenchymal stromal cells to support the survival of hematopoietic progenitor cells in vitro. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tezuka, T., Kasahara, T., Ueno, Y., Nishiyama, C., Oda, A., Goitsuka, R.
  • 学会等名: The 45th Annual Meeting of The Japanese Society for Immunology
  • 発表場所: 沖縄
  • 年月日: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [学会発表] Interdependent roles of Tlx1-expressing mesenchymal cells and macrophages in extra medullary hematopoiesis in the spleen. (2016)
  • 著者名/発表者名: Oda, A., Tezuka, T., Kasahara, T., Ueno, Y., Nishiyama, C., Goitsuka, R.
  • 学会等名: The 45th Annual Meeting of The Japanese Society for Immunology
  • 発表場所: 沖縄
  • 年月日: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [学会発表] インフラマソーム構成分子NLRP3遺伝子の単球系細胞特異的発現制御機構の解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本満智子、八代拓也、笠倉和巳、西山千春
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] 樹状細胞におけるPD-L2の遺伝子発現制御機構の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 渡辺良介、八代拓也、笠倉和巳、西山千春
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] マスト細胞における転写因子Ehfの機能解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 内田万紀子、中野信浩、原むつ子、笠倉和巳、八代拓也、西山千春
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] NR4a3によるマクロファージにおけるMDC/CCL22発現調節 (2016)
  • 著者名/発表者名: 内田佑奈、八代拓也、笠倉和巳、西山千春
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] PU.1を標的としたマスト細胞依存性アレルギー反応の制御 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小田祥人、笠倉和巳、八代拓也、西山千春
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] 樹状細胞の免疫調節機能に対するPterostilbeneの作用 (2016)
  • 著者名/発表者名: 由良志織、八代拓也、笠倉和巳、西山千春
  • 学会等名: 日本食品免疫学会2016年度大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2016-11-09 – 2016-11-10
• [学会発表] 短鎖脂肪酸によるマスト細胞の機能制御 (2016)
  • 著者名/発表者名: 藤垣泉、笠倉和巳、八代拓也、西山千春
  • 学会等名: 日本食品免疫学会2016年度大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2016-11-09 – 2016-11-10
• [学会発表] Tannic acidによるアレルギー抑制効果とメカニズム解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 濱田琢人、笠倉和巳、八代拓也、西山千春
  • 学会等名: 日本食品免疫学会2016年度大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2016-11-09 – 2016-11-10
• [備考] PUBLICATIONS
  • URL: http://www.rs.tus.ac.jp/chinishi/publications.html
• [備考] NEWS
  • URL: http://www.rs.tus.ac.jp/chinishi/news.html
• [備考] RESEARCH
  • URL: http://www.rs.tus.ac.jp/chinishi/research.html
• [備考] 本学大学院生が第39回日本分子生物学会年会優秀ポスター賞を受賞
  • URL: http://www.tus.ac.jp/today/archive/20170130002.html
• [備考] 西山千春 教員プロフィール 東京理科大学
  • URL: https://www.tus.ac.jp/fac_grad/p/index.php?6821