| 研究課題/領域番号 |
16K15206
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
櫻井 隆 順天堂大学, 医学部, 教授 (70225845)
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| 研究分担者 |
根本 直人 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60509727)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 神経科学 / プロテオーム / 組換え抗体 |
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| 研究実績の概要 |
フルオレセイン標識抗体と光照射によるリアルタイム蛋白質不活性化法 (FALI) は、相互作用の場における時間分解能の高いタンパク質機能解析法である。これを効率化して細胞機能アッセイに適用し、特定の細胞間相互作用に関与する細胞表面分子を同定して創薬標的探索法として確立することを目指している。cDNA display技術を単一ドメイン抗体ライブラリー(VHH)に応用してFALIを行い、細胞機能アッセイ系と一体化させるための基盤技術を確立する。
本年度は、多様性を維持したライブラリーをなるべくスモールスケールで取り扱うため、化学合成VHHライブラリー cDNA displayの発現効率向上の検討を中心に行った。研究分担者が開発した光架橋によりmRNAと高効率に結合可能な改良型リンカー、最適な磁気ビーズの選択、反応条件、特に無細胞タンパク質合成系の至適化により、さらなる発現効率向上が可能であることが明らかとなった。
また、クローン選択条件設定のために必要な、GFPやペプチドタグに高親和性に結合するVHHクローンcDNA displayを作製し、抗原への結合確認とともに反応条件の検討を行った。
以上の検討結果にもとづき、膜タンパク質の細胞外ドメイン由来ペプチドを含む3種のペプチドを磁気ビーズに固定化し、VHHライブラリーのスクリーニングの試行を行った。これによりランダムな変異を導入してより高い親和性を持つクローンを得るための条件設定が可能となった。引き続きクローン選択の条件検討を進めるとともに、cDNA display発現効率の向上を図っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度のVHHライブラリー cDNA displayの発現効率向上の検討により、十分な多様性を維持したライブラリーをスモールスケールで取り扱うことが可能となった。
また、VHHライブラリーのスクリーニングの試行によりランダム変異導入による高親和性クローン選択のための条件設定が可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、これまでに確立した実験条件をもとに、モデル系を用いて高親和性のVHHクローンを得るための変異導入実験を開始する。あわせて、研究分担者と協議しつつ、アッセイに十分な量のcDNA displayクローンを高効率で合成するための基盤技術開発を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
VHHライブラリーのcDNAディスプレイ発現効率向上が達成され、当初の予定よりも無細胞タンパク質合成系等の試薬・キット類の使用量が少なかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今後は、VHHライブラリーを用いた結合クローン選択、変異導入による高親和性クローン取得、VHHクローンの高効率合成のために試薬・キット類を多く使用する予定であり、そのために研究費を使用する。
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