| 研究課題/領域番号 |
16K15207
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
阪本 英二 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40291067)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 心臓病 / 心筋症 |
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| 研究実績の概要 |
心筋症などの心臓病は心筋の形態や機能の異常で発症するが、その背後にある分子病態は複雑である。心筋細胞には細胞膜が陥入して筋原線維のZ線に達するT管という特殊な膜構造が存在し、それによって細胞表面の電気的興奮は全ての筋原線維に均等に伝搬される。その結果、T管に近接する筋小胞体からCa2+が放出され、筋原線維が収縮する。それゆえ、心臓病で見られる細胞内遊離Ca2+濃度調節の破綻は、Ca2+の異常な濃度上昇に対する防御機構やT管や筋小胞体の支持分子機構の崩壊でも起きうると考えられる。
本研究では、こうした独自の視点から心臓病の分子病態をさらに解明すべく、研究シーズとして心筋症を突然変異で発症するハムスターを用いる。心筋症ハムスターには、心筋拡張の著明なTO-2と心筋肥大の著明なBIO14.6など様々な亜系統が存在する。我々は、先にその共通の遺伝的原因がδ-サルコグリカン（δSG）の欠損であることを明らかにしている。本研究ではこれら心筋症ハムスターにおける様々な遺伝子異常の解明を通じ、所期の目的を達成する。
当該年度は、新たな心筋機能調節分子としての可能性があるβB1-クリスタリン（βB1）を単独で欠損するハムスターの系統確立を目指し、ハムスターの交配を数世代に及び行った。BIO14.6と正常ハムスターはδSGとβB1遺伝子に関して異常ホモ(-/-, -/-)と正常ホモ（+/+, +/+）である。これらを交配させると、第１世代は全例がヘテロ(+/-, +/-)であった。第２世代ではδSGが(+/+)になる比率はおよそ1/4でβB1も(-/-)になる比率はおよそ1/16、それが♂あるいは♀である比率はおよそ1/32であった。さらに、これらの♂と♀を交配させ、第３世代において全例が（+/+, -/-）の個体が生まれた。今後はさらに交配を重ね、新たな疾患モデル動物系統として確立させる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、これまでのところおおむね順調に進んでいると考えられる。その理由は、「βB1-クリスタリン単独欠損ハムスターの創出」という当該年度の研究計画をほぼ遂行したからである。
その上、ハムスターの交配に要する待ち時間を有効活用し、本研究に深く関連する重症心筋症ハムスターTO-2の詳細な分子病態の解明も進めることが出来た。
すなわち、TO-2では心室筋のT管とZ線の微細構造が崩壊することを我々は見出した。Z線を構成するタンパク質の発現をウエスタンブロットによって検討することで、TO-2では加齢と共にデスミンが特異的に減少していることを見出した。さらに、デスミンのcDNAを単離し、その塩基配列を調べたところ、TO-2のデスミンは191番目のアミノ酸がアラニンからスレオニンに変異していることが分かった。このアミノ酸の変異により、特定のキナーゼによるリン酸化配列が生ずるが、実際のリン酸化は検出できなかった。また、当該変異アミノ酸が存在するコイル-１ドメイン同士の結合親和性は、in vitroのタンパク質結合実験では明瞭な差異は検出できなかった。しかし、中間系フィラメントの欠損株であるSW13細胞に正常と変異デスミンを発現させることで、TO-2のデスミンは線維形成能が正常に比べて若干劣ることが分かった。今後さらに、この変異デスミン分子の特性と心筋症の重症化への影響を詳細に検討したい。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究実績の概要と現在までの達成度で記したように、本研究はこれまでのところおおむね順調に進んでいる。そこで、翌年度の研究は当初の計画通り、以下のように推進する。
βB1-クリスタリン（βB1）単独欠損ハムスターに関しては、まず、初年度に得たβB1単独欠損ハムスターの数匹の♂と♀を交配させ、新しい疾患モデル動物の系統として確立させる。次に、このβB1単独欠損ハムスターの先祖であるBIO14.6ハムスターにおけるβB1のゲノム変異の解析を進める。我々は、この変異βB1遺伝子はエクソン１がエクソン２ではなくエクソン４とスプライスすることまでは見出しているが、今後その詳細な分子メカニズムを解明する。また、βB1タンパク質の心筋細胞内の局在を、ランゲンドルフ灌流装置で単離した心筋細胞を用いた蛍光免疫染色法などで明らかにする。さらに、βB1の遊離Ca2+への結合能を調べ、心筋細胞内の遊離Ca2+濃度をβB1単独欠損ハムスターと正常ハムスターで比較検討するなどし、βB1の心筋における機能を分子、細胞レベルで検討する。さらに可能であれば、他のクリスタリンの発現と局在についても同様に調べる。
一方、TO-2における心筋症の重症化に関する分子メカニズムに関してさらなるも詳細な検討を行う。すなわち、デスミン分子の一見些細な異常が、なぜTO-2のT管とZ線を破綻させ、心機能の著しい低下を招くのかという謎に迫る。
最終的に以上の結果を総合し、βB1-クリスタリンの心臓における生理機能ならびにその異常と心臓病の発症・増悪との関係について考察を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ハムスターの交配を予定以上に順調に進めることができたため、助成金に若干の剰余を残すことができた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
この剰余分は翌年度分として請求した助成金と合わせ、今年度に創出した疾患モデルハムスターを用いて行う翌年度の実験をより充実させるべく使用する計画である。
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