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2016 年度 実施状況報告書

炎症・免疫シグナルを制御する新規脱ユビキチン化酵素の同定と阻害剤探索

研究課題

研究課題/領域番号 16K15210
研究機関大阪市立大学

研究代表者

徳永 文稔  大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (00212069)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2018-03-31
キーワード酵素 / タンパク質 / 細胞・ 組織 / バイオテクノロジー / 生体機能利用
研究実績の概要

本研究で我々は、「炎症・免疫シグナルを制御する新規脱ユビキチン化酵素(DUB)の同定と阻害剤探索」として、ヒト全93種のDUBから炎症・免疫シグナルに重要なNF-κBとインターフェロン(IFN)産生経路の制御に関わるものを同定することを目指した。特に、LUBACによる直鎖状ユビキチン鎖生成を介したNF-κB活性化に対して抑制的に働くDUBを重点的に研究するとともに、同定されたDUBに対する阻害性化合物を探索し、生化学・細胞生物学的に解析することを目的とした。
本年度の研究成果として我々は、アポトーシス惹起時にLUBACの活性中心サブユニットであるHOIPがカスパーゼによって特異的に限定分解を受け、N末端領域ではNF-κB活性を抑制するDUBであるOTULINやCYLD-SPATA2複合体に結合し、基質であるNEMOやFADDの脱ユビキチン化を亢進することを見出した(Goto E. & Tokunaga F., BBRC, 2017)。カスパーゼによる限定分解で派生するC末端領域はユビキチンリガーゼ活性を保持するので、全般的に脱ユビキチン化が促進する点は興味深い。また、直鎖状ユビキチン鎖結合性タンパク質であるoptineurin(OPTN)のNF-κB活性抑制、アポトーシス制御、直鎖状ユビキチン鎖結合性喪失と筋萎縮性側索硬化症発症との関連を解明した(Nakazawa S. et al., Nat. Commun., 2016)、
さらに我々は、直鎖状ユビキチン鎖を特異的に分解するOTULINに対する阻害剤を探索し、共通構造を持った4つの化合物を同定した。これらは少なくともin vitroではOTULINの活性を抑制することを突き止めた。今後、より詳細な細胞レベル、個体レベルでの機能解析を進める予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、本研究に関連して上記のBBRC (2017)に加えてNature Communications (2016)など6編の原著論文発表を行った。これらを通して、NF-κBを中心とする炎症・免疫シグナルを制御する直鎖状ユビキチン修飾の生理的・病理的役割の解明を進めることができた。また、28年度の研究からOTULINに対する新規阻害剤も同定されており、29年度により詳細な研究進展が期待できるため、本研究は「おおむね順調に進展している」と判断した。

今後の研究の推進方策

平成29年度には、平成28年度の研究成果を更に発展させ、次の解析を行う。
I. 免疫・炎症シグナル制御に関わる新規DUBの生理機能
①平成28年度のスクリーニングから同定される炎症・免疫シグナル制御性DUBの生理機能を明らかにするため、Cas9/CRISPR法によりノックアウト細胞・マウスの作製に着手する。②得られたKO細胞・マウスを用いて、NF-κB、MAPキナーゼ、IFN産生シグナル、リンパ球やマクロファージなどの数・機能、生化学的数値、全身的な表現型を解析する。平成28年度の研究と併せて、新規DUBの生化学、細胞生物学、in vivoでの役割が解明される。
II. DUBインヒビターの探索と展開
①OTULINインヒビターに関しては、共結晶構造解析を進め、化合物による直鎖状ユビキチン結合やOTULIN阻害の分子基盤を明らかにするとともに、より選択的で阻害能の高い化合物をモデリングし、創薬シーズとしてブラッシュアップする。化合物のコア構造と生理機能に関して知財獲得を目指す。②OTULINインヒビターのがん転移や病態モデルマウスへの影響を明らかにするため、まず候補化合物をマウス(B6や免疫不全マウス)に投与した場合の毒性を確認し、がん細胞株を免疫不全マウスに異種接種した場合の腫瘍形成に与える影響を検討する。関節リウマチ(SKGマウスなど)やSLE(CD72欠損マウスなど)の自己免疫疾患モデルマウスを用いて、候補化合物を投与した場合の病態発現への影響を明らかにする。③平成28年度の研究から同定された新規炎症・免疫シグナル制御性DUBの阻害剤を化合物ライブラリーからアルファスクリーン法にて探索する。得られた化合物については、先行するOTULINインヒビターと同様に生化学・細胞生物学的解析を行い、モデルマウスを用いた疾患への応用を検討する。

次年度使用額が生じた理由

28年度は、7月に研究室の異動があったことや、主にin vitroレベルでの研究を進めたため、当初の計画より少額で研究を進展することができた。研究成果の遅延はなく、当初の研究目標はおおむね達成できたと考えている。次年度の消耗品購入費が予定より多く必要になると考えられ、次年度に活用する。

次年度使用額の使用計画

29年度では研究の進展に伴って、細胞レベルでの研究を行うと伴に、免疫不全マウスなどモデル実験動物を使用する予定であり、これらの高価な消耗品購入のため前年度の経費を合わせて使用する。現在のところ、実験期間については延長の予定はなく、他の経費の増額や備品の購入はない。また、今年度中に全額を使用し、研究目的の達成を図る。

  • 研究成果

    (14件)

すべて 2017 2016 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 4件、 謝辞記載あり 6件) 学会発表 (6件) (うち招待講演 3件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] HTLV-1 Tax induces formation of the active macromolecular IKK complex by generating Lys63- and Met1-linked hybrid polyubiquitin chains.2017

    • 著者名/発表者名
      Shibata Y, Tokunaga F, Goto E, Komatsu G, Gohda J, Saeki Y, Tanaka K, Takahashi H, Sawasaki T, Inoue S, Oshiumi H, Seya T, Nakano H, Tanaka Y, Iwai K, and Inoue J.
    • 雑誌名

      PLoS Pathog.

      巻: 13 ページ: -

    • DOI

      10.1371/journal.ppat.1006162.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Reduced SHARPIN and LUBAC formation may contribute to CCl4- or acetaminophen-induced liver cirrhosis in mice.2017

    • 著者名/発表者名
      Yamamotoya T, Nakatsu Y, Matsunaga Y, Fukushima T, Yamazaki H, Kaneko S, Fujishiro M, Kikuchi T, Kushiyama A, Tokunaga F, Asano T, and Sakoda H.
    • 雑誌名

      Int. J. Mol. Sci.

      巻: 18 ページ: -

    • DOI

      10.3390/ijms18020326.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] ER stress in the pathogenesis of pretibial dystrophic epidermolysis bullosa.2017

    • 著者名/発表者名
      Hattori M, Shimuzu A, Oikawa D, Kamei K, Kaira K, Ishida-Yamamoto A, Nakano H, Sawamura D, Tokunaga F, and Ishikawa O.
    • 雑誌名

      Br. J. Dermatol.

      巻: 印刷中 ページ: 印刷中

    • DOI

      10.1111/bjd.15342.

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Decreased linear ubiquitination of NEMO and FADD on apoptosis with caspase-mediated cleavage of HOIP.2017

    • 著者名/発表者名
      Goto E and Tokunaga F.
    • 雑誌名

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      巻: 485 ページ: 152-159

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2017.02.040.

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Linear ubiquitination is involved in the pathogenesis of optineurin-associated amyotrophic lateral sclerosis.2016

    • 著者名/発表者名
      Nakazawa S, Oikawa D, Ishii R, Ayaki T, Takahashi H, Takeda H, Ishitani R, Kamei K, Takeyoshi I, Kawakami H, Iwai K, Hatada I, Sawasaki T, Ito H, Nureki O, and Tokunaga F.
    • 雑誌名

      Nat. Commun.

      巻: 7 ページ: -

    • DOI

      10.1038/ncomms12547.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Structural and functional analysis of DDX41: a bispecific immune receptor for DNA and cyclic dinucleotide.2016

    • 著者名/発表者名
      Omura H, Oikawa D, Nakane T, Kato M, Ishii R, Ishitani R, Tokunaga F, and Nureki O.
    • 雑誌名

      Sci. Rep.

      巻: 6 ページ: -

    • DOI

      10.1038/srep34756.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] コムギ無細胞タンパク質アレイ解析によって見出された、NEMO結合性新規DUBのNF-κB制御機構の解析2016

    • 著者名/発表者名
      高橋宏隆, 桑田翔平, 後藤栄治, 徳永文稔, 澤崎達也
    • 学会等名
      第39回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2016-12-02
  • [学会発表] コムギ無細胞ヒト20,000種プロテインアレイを基盤とした直鎖状ポリユビキチン鎖結合タンパク質の探索2016

    • 著者名/発表者名
      中島達朗, 高橋宏隆, 徳永文稔, 澤崎達也
    • 学会等名
      第39回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2016-12-01
  • [学会発表] コムギ無細胞系を基盤としたヒトの脱ユビキチン化酵素(DUB)プロテインアレイを用いたポリユビキチン基質特異性解析2016

    • 著者名/発表者名
      桑田翔平,岡田健吾, 高橋宏隆, 後藤栄治, 徳永文稔, 澤崎達也
    • 学会等名
      第39回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2016-12-01
  • [学会発表] Optineurinの直鎖状ユビキチン鎖結合性と筋萎縮性側索硬化症2016

    • 著者名/発表者名
      徳永文稔
    • 学会等名
      第39回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2016-11-30
    • 招待講演
  • [学会発表] 筋萎縮性側索硬化症(ALS)における直鎖状ユビキチン鎖の寄与2016

    • 著者名/発表者名
      徳永文稔
    • 学会等名
      第89回日本生化学会大会
    • 発表場所
      仙台国際センター(宮城県仙台市)
    • 年月日
      2016-09-26
    • 招待講演
  • [学会発表] 直鎖状ユビキチン鎖による炎症・免疫シグナル制御とその破綻による疾患2016

    • 著者名/発表者名
      徳永文稔
    • 学会等名
      第67回日本電気泳動学会総会
    • 発表場所
      釧路市観光国際交流センター(北海道釧路市)
    • 年月日
      2016-08-27
    • 招待講演
  • [備考] 大阪市立大学大学院医学研究科分子病態学

    • URL

      http://osaka-cu-1seika.umin.jp/

  • [備考] 大阪市立大学大学院医学研究科

    • URL

      http://www.med.osaka-cu.ac.jp/departments/bunshi-pathobiochemistry.shtml

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公開日: 2018-01-16  

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