| 研究課題/領域番号 |
16K15215
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
縣 保年 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60263141)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | がん免疫細胞療法 / Ｔ細胞受容体（TCR） / T-iPS細胞 / TCR-iPS細胞 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / カセット交換法（RMCE） / Cre/loxP |
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| 研究実績の概要 |
従来のがん免疫細胞療法は、がん抗原特異的なキラーT細胞を刺激して働かせるという戦略を取っているが、その効果は限定的であった。本研究は、がん抗原特異的Ｔ細胞からiPS細胞技術を用いてキラーＴ細胞を再生する方法をより発展させることを目指した。そのために、がん抗原特異的Ｔ細胞からＴ細胞受容体（TCR）遺伝子を単離し、iPS細胞にレンチウイルスを用いて直接遺伝子導入を行い、TCR遺伝子導入iPS細胞（TCR-iPS細胞）を作製することに成功した。一方、TCR-iPS細胞から分化誘導したT細胞では、TCRの発現レベルがやや低いことがわかった。またレンチウイルスを用いた遺伝子導入では、挿入によるがん化のリスクを完全に否定できない。そこで本研究では、ゲノム編集とカセット交換法を用いて、iPS細胞の内在性TCRβ遺伝子座へがん抗原特異的TCR遺伝子をノックインすることにより、TCRの発現レベルとキラー活性の高い再生T細胞を、短期間で効率よく作製することを目的とした。薬剤耐性遺伝子カセットをノックインした高品質なiPS細胞がひとたび作製できれば、カセット交換法により未知変異抗原に反応するTCR-iPS細胞を次々に作製することが可能であり、細胞製剤として早期の治療応用も期待できる。
iPS細胞ではT細胞へ分化誘導しないとTCRが発現しないので、まず実験系を確立するために、ヒトT細胞性白血病由来のJurkat細胞を用いて、ゲノム編集により薬剤耐性遺伝子カセットを内在性TCRβ遺伝子座へノックインした。次にCre/loxPシステムを用いたカセット交換法により、TCRα/β遺伝子を薬剤耐性遺伝子と交換反応により挿入することにより、外来性TCR遺伝子を効率よく発現させることに成功した。以上の結果をふまえiPS細胞へのノックインを開始し、カセット交換以降の実験を引き続き実施予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
①ゲノム編集とカセット交換法を用いて内在性TCRβ遺伝子座へTCRα/β遺伝子をノックインすることを試みた。まずVβ20-1プロモーターによって発現するHygromycin耐性遺伝子と、Puromycin耐性遺伝子とチミジンキナーゼの融合遺伝子（Puro-TK）からなるカセットを作製し、その上下に5'アームと3'アームを付加したターゲティングベクターを構築した。次にアームの内側にニックを導入するガイドRNAを設計し、Cas9ニッカーゼ（Cas9n）と共発現するベクターを構築した。iPS細胞ではT細胞へ分化誘導しないとTCRが発現しないので、まず実験系を確立するために、ヒトT細胞性白血病由来のJurkat細胞を用いてノックインを試みた。Jurkat細胞にターゲティングベクターとCRISPR/Cas9nベクターを導入後、Hygromycinで選択しノックインされたクローンを得た。
②次にWT1抗原特異的なTCRαとTCRβを、p2Aペプチドでつないだ融合遺伝子の前にlox2272配列を付加し、下流にfrt配列、PGKプロモーター、loxP配列を付加したカセット交換用ベクターを構築した。これをCre発現ベクターとともに上記のノックインされたJurkat細胞へ導入した。lox2272とloxP配列はそれぞれの間でのみCreによって組換えが起こるため、Hygromycin耐性遺伝子とTCRα/β遺伝子が交換されるとともに、PGKプロモーターによってPuro-TK遺伝子が発現するようになる。Puromycinで選択し正しい交換を確認した。
③TCRα/β遺伝子が挿入されたJurkat細胞にFLPe発現ベクターを導入し、frt配列で挟まれたPuro-TK遺伝子が欠失した細胞をガンシクロビルで選択した。その結果、導入されたTCRα/β遺伝子が発現することが確認できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
Jurkat細胞を用いた上記の実験系で、導入した外来性のがん抗原特異的TCR遺伝子の発現が確認できたことから、iPS細胞でも同様の手順で実験系が正しく行われることが予想された。そこでiPS細胞を用いて、ターゲティングベクターをCRISPR/ Cas9nベクターとともに遺伝子導入を行い、既に薬剤耐性遺伝子カセットのノックインまで終了し、現在カセット交換反応を実施している。
TCRα/β遺伝子が内在性TCRβ遺伝子座へ挿入されたTCR-ノックインiPS細胞が作製できれば、それをT細胞へ分化誘導する。具体的には、T細胞分化を誘導するNotchリガンドDLL1を発現したOP9/DLL1細胞の上で培養し、さらに抗CD3抗体で刺激することでCD8陽性の成熟細胞傷害性T細胞へと分化誘導する。こうしてできた成熟T細胞のがん抗原反応性と細胞傷害活性を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は、ゲノム編集とカセット交換法を用いて、がん抗原特異的TCRα/β遺伝子をiPS細胞の内在性TCRβ遺伝子座へ効率よくノックインすることと、TCR-ノックインiPS細胞が作製できれば、それをT細胞へ分化誘導し、成熟T細胞のがん抗原反応性と細胞傷害活性を検討する計画であった。
しかしiPS細胞ではT細胞へ分化誘導しないとTCRが発現しないので、まず実験系を確立するために、当初計画していなかったヒトT細胞性白血病由来のJurkat細胞を用いてノックインを試みた。薬剤耐性遺伝子カセットがノックインされたクローンが得られ、カセット交換法によりTCRα/β遺伝子が交換でき、FLPeによりTCRα/β遺伝子の発現が確認できた。以上の結果をふまえiPS細胞へのノックインを開始し、カセット交換以降の実験を引き続き次年度に実施することになったため。
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