「母性Cas9」による多遺伝子編集マウス開発と多因子性疾患の解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K15233
• 研究機関: 信州大学
• 研究代表者: 桜井 敬之 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (80317825)
• 研究分担者: 新藤 隆行 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (90345215)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: アトドレノメデュリン / 多因子性疾患 / 高血圧 / ゲノム編集 / CRISPR / 母性Cas9 / RAMP / 発生工学

研究実績の概要

多機能アトドレノメデュリン(AM)とその受容体活性調節タンパクRAMP(R)の機能異常の主要病態は多因子性疾患の高血圧である。AM研究をより臨床応用へ近づけるため、我々は最近、論文発表した母性型Cas9を活用する同時多遺伝子編集を用いて多因子性を反映した疾患マウス開発と解析を開始した。
高血圧のGWAS解析で変異報告のあるAMを含めたヒト９遺伝子について、その相同域のマウスゲノム配列を解析した。多くはヒト配列と高い相同性は認められなかった。相同性が認められた遺伝子ではマウスでのその変異領域を、無いものは相同のマウス遺伝子自身のタンパク質翻訳配列にgRNA配列を設定・合成した。これら９種のgRNA群は母性型Cas9を含む受精卵に同時導入した。同受精卵は偽妊娠マウスに移植、その仔を得ることに成功し、これらオスを多因子性高血圧症候補マウス群とした。仔マウスは(1)対象遺伝子の変異がそれぞれ異なっており、かつ(2)　殆どはヘテロ型変異であり、事前の想定通りスクリーニングに適していると考えた。本年度は４回実施し、現在、５回目を継続している。これら候補マウスは8週齢-15週齢にかけて血圧（脈拍数、収縮期、拡張期、平均値）を測定し、その数値と各々の遺伝子変異との関係を探っている。
一方で、同時多遺伝子編集ための高率ノックイン(KI)技術の開発も試みた。HDR活性によるKI効率改良を目指したため、マウス受精卵のDNA複製期(受精後５－８ｈ)に注目し、CRISPR/Cas9因子（対象遺伝子gRNA、KI用断片、Cas9（母性Cas9を活用する場合は含めず）の導入法検討、および既報のNHEJ活性の阻害剤添加の併用などを実施した。その結果、KI高効率(90％)の場合も得たが安定性に欠けていた。高効率KIの安定取得のための要因解明を含め、マウス初期胚におけるKI最適化条件を探っている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

母性Cas9による同時遺伝子変異マウス作製法が期待通り活用でき、多因子性高血圧症候補マウス群の作製に成功した。また同時多遺伝子編集ための高率ノックインKI技術の開発の過程で、母性Cas9によるゲノム編集法に関する新規データが得られた(投稿中)。

今後の研究の推進方策

母性Cas9含受精卵を用いる多因子性高血圧症候補マウス作製は継続し、多因子性高血圧候補遺伝子変異と高血圧との相関性を詳細に明らかとする。さらに先行解析中のＡＭを含む９遺伝子群に対しては、次候補の高血圧候補遺伝子群から一部の交換による組み合わせ変更も検討する。そして多因子性高血圧症候補マウスの治療の検討を実施する。

研究成果

• [雑誌論文] Vasoprotective activities of the adrenomedullin-RAMP2 system in endothelial cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Xian X, Sakurai T, Kamiyoshi A, Ichikawa-Shindo Y, Tanaka M, Koyama T, Kawate H, Yang L, Liu T, Imai A, Zhai L, Hirabayashi K, Dai K, Tanimura K, Liu T, Cui N, Igarashi K, Yamauchi A, Shindo T.
  • 雑誌名: Endocrinology. 巻: 158 ページ: 1359-1372
  • DOI: 10.1210/en.2016-1531
  • 査読あり
• [雑誌論文] Endogenous calcitonin gene-related peptide regulates lipid metabolism and energy homeostasis in male mice. (2017)
  • 著者名/発表者名: Liu T, Kamiyoshi A, Sakurai T, Ichikawa-Shindo Y, Kawate H, Yang L, Tanaka M, Xian X, Imai A, Zhai L, Hirabayashi K, Dai K, Tanimura K, Liu T, Cui N, Igarashi K, Yamauchi A, Shindo T.
  • 雑誌名: Endocrinology. 巻: 158 ページ: 1194-1206
  • DOI: 10.1210/en.2016-1510.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adrenomedullin Suppresses Vascular Endothelial Growth Factor-Induced Vascular Hyperpermeability and Inflammation in Retinopathy. (2017)
  • 著者名/発表者名: Imai A, Toriyama Y, Iesato Y, Hirabayashi K, Sakurai T, Kamiyoshi A, Ichikawa-Shindo Y, Kawate H, Tanaka M, Liu T, Xian X, Zhai L, Dai K, Tanimura K, Liu T, Cui N, Yamauchi A, Murata T, Shindo T.
  • 雑誌名: Am J Pathol. 巻: 187 ページ: 999-1015
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2017.01.014.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The endothelial adrenomedullin-RAMP2 system regulates vascular integrity and suppresses tumour metastasis (2016)
  • 著者名/発表者名: Tanaka M, Koyama T, Sakurai T, Kamiyoshi A, Ichikawa-Shindo Y, Kawate H, Liu T, Xian X, Imai A, Zhai L, Hirabayashi K, Owa S, Yamauchi A, Igarashi K, Taniguchi S, Shindo T.
  • 雑誌名: Cardiovasc.Res 巻: 111 ページ: 398-409
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2017.01.014.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fluorescent protein tagging of endogenous protein in brain neurons using CRISPR/Cas9-mediated knock-in and in utero electroporation techniques (2016)
  • 著者名/発表者名: Uemura T, Mori T, Kurihara T, Kawase S, Koike R, Satoga M, Cao X, Li X, Yanagawa T, Sakurai T, Shindo T, Tabuchi K.
  • 雑誌名: Sci.Rep. 巻: 6 ページ: srep35861
  • DOI: 10.1038/srep35861
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 低酸素および炎症惹起性眼内血管新生病において、アドレノメデュリン-RAMP2 系は相反する意義を有する (2016)
  • 著者名/発表者名: 今井章、平林一貴、家里康弘、桜井敬之、神吉昭子、新藤優佳、河手久香、田中愛、村田敏規、 新藤隆行
  • 学会等名: 第20回日本心血管内分泌代謝学会
  • 発表場所: 大阪国際交流センター（大阪府大阪市）
  • 年月日: 2016-12-16 – 2016-12-17
• [学会発表] マウスすい臓内へのpiggyBac系を介した直接生体内遺伝子導入は外来遺伝子の長期発現を可能とする (2016)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 正宏、稲田 絵美、齋藤 一誠、三浦 浩美、大塚 正人、中村 伸吾、桜井 敬之、渡部 聡
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] piggyBacベクターシステムとin vivo gene transferを用いた新たな肝細胞株樹立の試み (2016)
  • 著者名/発表者名: 渡部 聡、中村 伸吾、桜井 敬之、大塚 正人、佐藤 正宏
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] Cas9 発現マウス樹立と、その母性 Cas9 活用による多遺伝子同時編集マウス作製の試み (2016)
  • 著者名/発表者名: 桜井 敬之
  • 学会等名: 39回日本分子生物学会 ランチョンセミナー
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
  • 招待講演
• [学会発表] .A multiple-gene modified mouse production by using maternal Cas9 in the zygotes prepared from transgenic mice systemically expressing Cas9 (2016)
  • 著者名/発表者名: 桜井敬之，神吉昭子，河手久香、森智恵、渡部聡、佐藤正宏、新藤隆行
  • 学会等名: 第１回日本ゲノム編集学会
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島県広島市）
  • 年月日: 2016-09-06 – 2016-09-07
• [学会発表] 急性および慢性脳虚血におけるカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の病態生理学的意義 (2016)
  • 著者名/発表者名: テキ留玉、五十嵐恭子、桜井敬之、神吉昭子、新藤優佳、河手久香、山内啓弘、田中愛、劉甜、 羨鮮、今井章、平林一貴、載昆、崔南奇、劉騰、谷村圭哉、新藤隆行
  • 学会等名: 第 34 回内分泌代謝学サマーセミナー
  • 発表場所: 久山温泉ホテル夢家（福岡県久山町）
  • 年月日: 2016-07-14 – 2016-07-16
• [学会発表] アドレノメデュリン-RAMP2システムは褐色脂肪細胞の細胞分化とエネルギー代謝を制御する (2016)
  • 著者名/発表者名: 神吉昭子、桜井敬之、新藤優佳、河手久香、田中愛、劉甜、羨鮮、今井章、Liuyu Zhai、平林一貴、大和慎治、載昆、崔南奇、劉騰、五十嵐恭子、山内啓弘、新藤隆行
  • 学会等名: 第89回日本内分泌学会
  • 発表場所: 京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2016-04-21 – 2016-04-23
• [学会発表] カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、白色脂肪組織の脂肪分解を抑制する (2016)
  • 著者名/発表者名: 劉甜、桜井敬之、神吉昭子、新藤優佳、河手久香、田中愛、羨鮮、今井章、 テキ留玉、平林一貴、 大和慎治、載昆、崔南奇、劉騰、五十嵐恭子、山内啓弘、新藤隆行
  • 学会等名: 第89回日本内分泌学会
  • 発表場所: 京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2016-04-21 – 2016-04-23
• [備考] 信州大学大学院医学系研究科循環病態学教室
  • URL: http://www7a.biglobe.ne.jp/̃shindo/
• [備考] 信州大学大学院医学系博士課程 疾患予防医科学系専攻 循環病態学
  • URL: http://www.shinshu-u.ac.jp/graduate/medicine/doctoral/m-science/saisei.html
• [産業財産権] 遺伝子改変非ヒト動物、受精卵及び標的遺伝子を選択的且つ部位特異的に改変するための方法 (2016)
  • 発明者名: 桜井敬之、新藤隆行
  • 権利者名: 国立研究開発法人科学技術振興機構
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2016/085391
  • 出願年月日: 2016-11-29
  • 外国