腸内細菌叢および腸管免疫系へ影響を及ぼす口腔内細菌の解析

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K15293
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 新 幸二 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (60546787)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 口腔細菌 / Th1細胞 / クレブシエラ

研究実績の概要

ヒトの腸管内腔には数百種類の腸内細菌が存在し、宿主の様々な生理機能に影響を与えている。そのため腸内細菌叢を構成する細菌種の多様性の減少や特定菌種の増減など腸内細菌異常（dysbiosis）が様々な疾患の発症と関連していることが明らかになってきているが、どのような原因でdysbiosisが起こるのか、どのような細菌種が疾患発症に直接関与しているかについては明らかになっていない。そこで本研究では、口腔内細菌が腸内に定着し腸管免疫系の活性化に寄与しているのではないかと考え、研究を行った。
昨年度に、クローン病患者の唾液中に存在していたK. pneumoniae 2H7株が腸管に定着し強いTh1細胞の誘導を引き起こすことが明らかになったため、本年度はK. pneumoniaeのTh1細胞誘導メカニズムの解析を行った。細菌バンクであるATCCやJCMなどから購入した様々なK. pneumoniaeを無菌マウスの腸内に定着させ、大腸のTh1細胞の誘導を比較したところ、強いTh1細胞誘導を引き起こす群、中程度に誘導を引き起こす群とほとんど誘導しない群に分けられることが明らかになった。これらの使用したすべての細菌のゲノム解読を行い、どのような遺伝子がTh1細胞誘導と相関するのかを解析した。その結果、長鎖脂肪酸・マンノース・フルクトース・ガラクチトール・4型分泌装置などに関与する61個の遺伝子が候補として引っかかってきた。今後これらの機能がどのようにTh1細胞の誘導に関与しているのかを解析する予定である。また一方で、強くTh1細胞を誘導する40B3株とほとんど誘導しないKCTC2242株のゲノム配列が非常に相同性が高いことを見出し、これら2株間で異なる遺伝子を229個同定した。上記の解析とともにこれら2株の違いからもTh1細胞の誘導に関与している細菌側の遺伝子を同定していく予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

口腔由来のK. pneumoniaeが腸内に定着し、大腸のTh1細胞を強く活性化することを突き止めた。その後、K. pneumoniaeによるTh1細胞誘導メカニズムの解明に取り掛かっている。K. pneumoniaeは肺炎患者や土壌など様々な場所から株が単離されており、合計10株のK. pneumoniaeを手に入れることができた。それらすべてをそれぞれ無菌マウスの腸管に定着させ、大腸のTh1細胞の誘導を解析したところ、強くTh1細胞を誘導する株が5株、中程度に誘導する株が3株、ほとんど誘導しない株が2株あった。これらの株のゲノム配列を解読し、どのような遺伝子が異なっているのかを解析し、K. pneumoniaeのTh1細胞誘導メカニズムにつながる分子の同定を試みた。そこで、これらすべての株からゲノムDNAを抽出し次世代シーケンサーでゲノム配列を解読し、塩基配列ベースで95%以上の相同性で遺伝子の有無を検出した。Th1細胞誘導の強さと相関する遺伝子を網羅的に解析した結果、長鎖脂肪酸・マンノース・フルクトース・ガラクチトール・4型分泌装置などに関わる61個の遺伝子がTh1細胞誘導に関与する候補遺伝子として検出された。また10株のK. pneumoniaeのうち、強くTh1細胞を誘導する40B3株とほとんどTh1細胞を誘導しないKCTC2242株のゲノム塩基配列を比較すると非常に相同性が高いことを見出した。これら2株間の遺伝子の有無を比較し、強くTh1細胞を誘導する40B3株が有するがほとんどTh1細胞を誘導しないKCTC2242株が有しない遺伝子を229個同定した。また、そのうち本研究で単離した2H7株も有している遺伝子が41個存在していた。そのため、上記61個の遺伝子と、これら41個の遺伝子に着目しTh1細胞の誘導に関与している細菌側の遺伝子を同定していく予定である。

今後の研究の推進方策

同定したK. pneumoniae 2H7株によるTh1細胞誘導メカニズムを明らかにするため、以下の手順で研究を進める。
(1) Th1細胞を強く誘導する40B3株にあり、ほとんど誘導しないKCTC2242株にないTh1細胞誘導に関与していると推測される41個の遺伝子から、過去の文献情報を参考に特にTh1細胞誘導に関与している可能性が高いと考えられる遺伝子を10個程度に絞り込む。これら10の遺伝子を40B3株から欠損させた変異体を作成し、それぞれを無菌マウスに定着させTh1細胞の誘導を確認する。野生型40B3株と比較して有意にTh1細胞の誘導が弱かった変異体からどのような遺伝子がTh1細胞誘導に関与しているのかを同定する。もし、今回の10個の遺伝子欠損変異体でTh1細胞の誘導が変化しなかった場合は、もう一度新たな10個を選択し同様の実験を繰り返す。
Th1細胞の誘導が見られなくなった変異体が確認できた場合は、定着マウスの大腸内容物または盲腸内容物から細菌由来のRNA、代謝物を抽出し、トランスクリプトーム解析、メタボローム解析を行う。
(2) (1)の解析においてTh1細胞を誘導する細菌側の分子が同定された場合、野生型と欠損株を定着させたマウスの大腸から上皮細胞、樹状細胞、T細胞を単離しRNA-seqを行う。この解析から誘導分子による刺激で宿主にどのような遺伝子発現変化が起こるか、どのようなシグナル経路が動いているかについて解析を行う。
(3) (2)の解析により同定された宿主側のTh1細胞誘導に関与するシグナル経路に関わる遺伝子の欠損マウスが手に入る場合は、当該欠損マウスに40B3株または2H7株を定着させ、Th1細胞誘導に変化がないかを解析する。もし欠損マウスが手に入らない場合は、阻害剤等を用いて、Th1細胞誘導に変化がないかを解析する。

次年度使用額が生じた理由

本年度に行う予定であったトランスクリプトーム解析、メタボローム解析の条件検討に時間がかかったため実施できず、来年度に実施する予定にした。

研究成果

• [雑誌論文] Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives T(H)1 cell induction and inflammation (2017)
  • 著者名/発表者名: Atarashi K, Suda W, Luo C, Kawaguchi T, Motoo I, Narushima S, Kiguchi Y, Yasuma K, Watanabe E, Tanoue T, Thaiss CA, Sato M, Toyooka K, Said HS, Yamagami H, Rice SA, Gevers D, Johnson RC, Segre JA, Chen K, Kolls JK, Elinav E, Morita H, Xavier RJ, Hattori M, Honda K
  • 雑誌名: Science 巻: 358 ページ: 359-365
  • DOI: 10.1126/science.aan4526
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] 口腔由来クレブシエラ菌の腸内定着と炎症誘導 (2018)
  • 著者名/発表者名: 新幸二
  • 学会等名: 第 27 回東京免疫フォーラム
  • 招待講演
• [学会発表] ヒト腸内フローラと免疫機能 (2017)
  • 著者名/発表者名: 新幸二
  • 学会等名: 平成29年度 (公社)日本実験動物学会 維持会員懇談会
  • 招待講演
• [産業財産権] Th1細胞を誘導するヒト口腔内細菌 (2017)
  • 発明者名: 本田賢也、新幸二、成島聖子、須田亙、服部正平
  • 権利者名: 本田賢也、新幸二、成島聖子、須田亙、服部正平
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2017/039522
  • 外国