| 研究課題/領域番号 |
16K15319
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
林 日出喜 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (10218589)
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| 研究分担者 |
長谷川 寛雄 長崎大学, 病院(医学系), 講師 (00398166)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | レンチウイルスベクター / ゲノム編集 / 遺伝子治療 / CRISPR/Cas9 / 遺伝子増幅 |
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| 研究実績の概要 |
ゲノム編集技術CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9を利用した「自己削除型」レンチウイルスベクターによる遺伝子治療法の開発のため、研究計画に従い、１）この自己削除型レンチウイルスベクターの構築を行った。まずこのsgRNAs(single-guide RNA)による特異的遺伝子のノックアウトがうまくいくか検討するため、既にノックアウト効果が知られているGFPの配列、及びレンチウイルスベクターのLTR(long terminal repeat)を標的とする複数の配列を、sgRNAの構成的な発現をさせるU6プロモーターの下流につないだものを作成した。
２）HTLV-1が感染したヒト培養細胞での実験、３）第二段階のTet(テトラサイクリン)を加え、sgRNA2の発現を誘導し、この自己削除型レンチウイルスベクターそのものの除去を確認する実験に先立ち、恒常的なノックアウト効果、及びTetによる誘導可能なノックアウトをGFP、DsRedといった蛍光で容易に判定のできる293T細胞(①293T細胞にGFPを恒常的に発現する細胞、②DsRedを恒常的に発現するレンチウイルスベクターを作成、感染させ、LTR-DsRed-LTRの形でゲノムに組込まれた293T細胞)を作成した。
これらの細胞にGFP、レンチウイルスベクターLTRを標的とするsgRNAを恒常的に発現させ、GFPおよびレンチウイルスベクターが除去できることを確認した。現在、これらのsgRNAを改変H1-2O2の下流につなぎTet-誘導性のGFPおよびレンチウイルスベクターの除去ができるか、検討しているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の実験計画２）HTLV-1が感染したヒト培養細胞での実験、３）第二段階のTet(テトラサイクリン)を加え、sgRNA2の発現を誘導し、この自己削除型レンチウイルスベクターそのものの除去を確認する実験に先立ち、恒常的なノックアウト効果、及びTetによる誘導可能なノックアウトをGFP、DsRedといった蛍光で容易に判定のできる293T細胞を作成したため、進捗が遅れることとなった。しかしながら、これらの細胞を用いることにより、恒常的なノックアウト効果が簡便に確認することができた。さらにTetによる誘導的なノックアウトの検討も詳細にできると期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これらの恒常的なノックアウト効果、及びTetによる誘導可能なノックアウトをGFP、DsRedといった蛍光で容易に判定のできる293T細胞を使って、Tetによる誘導的なノックアウトの検討を詳細に行う。H1プロモーターの改変により、市販のものに比べより強いTet誘導性の発現が可能となったが、さらにノックアウトの効率を上げるため、このTet誘導性発現ユニットを数個タンデムに配列させ、標的遺伝子の複数ヶ所を同時に切断する等の検討も考えている。
これらの細胞で、Tetによる誘導的なノックアウトが確認できれば、HTLV-1が感染したヒト培養細胞ST1細胞を用いて、HTLV-1のLTRを標的としたsgRNA1によるHTLV-1の除去、さらにTetによるsgRNA2の発現を誘導し、この自己削除型レンチウイルスベクターそのものの除去を行っていく予定である。
その段階で、sgRNAのオフターゲット効果（標的遺伝子以外で類似したDNA配列を持った遺伝子がノックアウトされること）、宿主細胞ゲノム全体の構造に変化等の有無を、次世代シーケンサー(北海道システム・サイエンス(株)のPindelとBreakDancerというプログラム)で細かく調べる計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験計画の変更に伴う進捗の遅れのため、次世代シーケンサー(北海道システム・サイエンス(株)のPindelとBreakDancerというプログラム)使用に計上していた予算の執行が遅れたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度に次世代シーケンサー(北海道システム・サイエンス(株)のPindelとBreakDancerというプログラム)使用に計上していた予算の執行を行う予定である。
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