| 研究課題/領域番号 |
16K15319
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
林 日出喜 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (10218589)
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| 研究分担者 |
長谷川 寛雄 長崎大学, 病院(医学系), 准教授 (00398166)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / 遺伝子ノックアウト / 「自己削除型」レンチウイルスベクター / AAV(アデノ随伴ウイルスベクター)ベクター |
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| 研究実績の概要 |
ゲノム編集技術CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9を利用した「自己削除型」レンチウイルスベクターによる遺伝子治療法の開発のため、研究計画に従い、１）この自己削除型レンチウイルスベクターの構築を行った。まず、このsgRNAs(single-guide RNA)による特異的遺伝子のノックアウトを検討するため、恒常的なノックアウト効果、及びTetによる誘導可能なノックアウトをGFPの蛍光で容易に判定のできる293T細胞（LTR(long terminal repeat)-GFP-LTR、の形でランダムにゲノムに組込み）を作成した。これらの細胞にLTRを標的とするsgRNAを恒常的に発現させ、GFPの除去を確認した。そのノックアウト効果をsgRNA発現ユニットを１～数個タンデムに配列させて検討したところ、異なる箇所を2個ターゲットした場合が最も効率よく、ノックアウトできた。しかしながら、これらのsgRNAを改変H1-2O2の下流につなぎTet-誘導性のGFPの除去を検討したところ、Tetによる誘導性の除去ができなかった。複雑なベクター構築により、改変H1-2O2プロモーターの発現抑制が充分でなった可能性が考えられた。
本課題の実践的な目的は、レンチウイルスベクターを使った目的遺伝子のノックアウトの後、使用したレンチウイルスの除去である。そのため、1つのベクターにすべてのコンポーネントを収めるのではなく、レンチウイルスベクターによる目的遺伝子のノックアウトの後に、宿主細胞のゲノムに組込まれにくいAAVベクターを使うことにより、ゲノムに組込まれたレンチウイルスベクターの除去を行う方法を検討した。この方法により20%くらいの効率でレンチウイルスベクターのが除去が確認された。
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