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2017 年度 実績報告書

終末糖化産物の構造を識別する機能性一本鎖抗体を用いた高感度画像解析法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 16K15321
研究機関熊本大学

研究代表者

森岡 弘志  熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (20230097)

研究分担者 小橋川 敬博  熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (90455600)
佐藤 卓史  熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (70555755)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2018-03-31
キーワード一本鎖抗体 / 終末糖化産物 / 機能性小型抗体 / 蛍光プローブ / クリックケミストリー
研究実績の概要

本研究では、生体内に局在する終末糖化産物(AGEs)修飾タンパク質を高感度でin vivoイメージングできるシステムの構築を目指して、新規機能性抗AGEscFv抗体を創製し、それらの分子を用いて糖尿病性血管合併症の発症・進展のメカニズムの解明と新たな治療戦略の開発を目的としている。
本年度は、AGE構造の一種であるGA-pyridineに特異的な一本鎖抗体AGE73scFvをもとに、ファージディスプレイ法によるスクリーニングによって、抗原親和性ならびに熱安定性が改良された変異体73MuL9scFvに関して、VH領域とVL領域をつなぐリンカー部分ならびにscFvのC末端領域にトリプトファンを受光部とするランタノイド金属イオンを錯体形成させるペプチド配列(LBPペプチド:YIDTNNDGWYEGDEL)を結合させ、ランタノイド蛍光プローブとしてテルビウムを用いたscFv分子を作製した。これらの分子は十分な抗原結合活性を有していたが、様々な条件検討を進めてみたがランタノイド蛍光を観察することはできなかった。
LBPペプチドによるscFv分子へのランタノイド蛍光導入が困難であったので、蛍光プローブ導入方法としてクリックケミストリーの利用を検討した。
アジド基とシクロオクチンを利用したクリックケミストリーによる蛍光導入を進めるため、scFv分子ならびにコントロール分子としてユビキチン(Ub)に非天然アミノ酸であるp-アジドフェニルアラニン(AzF)の導入を進めた。終止コドンの一つであるアンバーコドンを非天然アミノ酸に対応させるため、それらに対応するtRNAとアミノアシル合成酵素を用いるシステムを採用した。N末端またはC末端にAzFが導入された両組換えタンパク質の調製に成功し、現在、ユーロピウムイオンを捕捉したシクロオクチン化合物とのクリックケミストリーによる蛍光導入を進めている。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (11件) (うち招待講演 2件) 備考 (1件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] Development of an immunoassay for fluvoxamine detection using a recombinant single-chain variable fragment antibody2017

    • 著者名/発表者名
      Sasao Ako, Takaki Michiyo, Ohtsu Yuki, Mishima Satoko, Yonemitsu Kosei, Morioka Hiroshi, Nishitani Yoko
    • 雑誌名

      Forensic Toxicology

      巻: 35 ページ: 301~308

    • DOI

      doi:10.1007/s11419-017-0358-9

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Production of Single-Chain Fv Antibodies Specific for GA-Pyridine, an Advanced Glycation End-Product (AGE), with Reduced Inter-Domain Motion2017

    • 著者名/発表者名
      Fukuda N, Noi K, Weng LD, Kobashigawa Y, Miyazaki H, Wakeyama Y, Takaki M, Nakahara Y, Tatsuno Y, Uchida-Kamekura M, Suwa Y, Sato T, Ichikawa-Tomikawa N, Nomizu M, Fujiwara Y, Ohsaka F, Saitoh T, Maenaka K, Kumeta H, Shinya S, Kojima C, Ogura T, Morioka H
    • 雑誌名

      Molecules

      巻: 22 ページ: 1695

    • DOI

      doi:10.3390/molecules22101695

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] NMR解析に向けた終末糖化産物の1種であるGA-pyridineに対する一本鎖抗体(scFv)の創製2018

    • 著者名/発表者名
      翁 力棟,宮﨑広海,分山結加里,中原悠介,福田夏希,佐藤卓史,小橋川敬博,野井健太郎,小椋 光,久米田博之,前仲勝実,森岡弘志
    • 学会等名
      第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
  • [学会発表] ヒストン翻訳語修飾体を標的とする一本鎖抗体の機能評価2018

    • 著者名/発表者名
      寺本真香,池口友佳,福田夏希,佐藤卓史,小橋川敬博,木村 宏,森岡弘志
    • 学会等名
      第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
  • [学会発表] GA-pyridineを認識するフラグメント抗体(Fv-clasp)の結晶構造解析及び抗原認識機構の物理化学的解析2018

    • 著者名/発表者名
      豊田湧也,大原隼也,森田光佑,有森貴夫,佐藤卓史,小橋川敬博,中村照也,山縣ゆり子,高木淳一,森岡弘志
    • 学会等名
      第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
  • [学会発表] 実用化に向けた安定な一本鎖抗体の創製2018

    • 著者名/発表者名
      山内聡一郎,福田夏希,寺本真香,佐藤卓史,小橋川敬博,野井健太郎,小椋 光,森岡弘志
    • 学会等名
      第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
  • [学会発表] 大腸菌発現系を用いた一本鎖抗体の効率的試料調製法に関する研究2018

    • 著者名/発表者名
      劉 宸江,豊田湧也,福田夏希,佐藤卓史,小橋川敬博,森岡弘志
    • 学会等名
      第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
  • [学会発表] 一本鎖抗体を用いたAGEs修飾タンパク質の分離・濃縮法の開発2017

    • 著者名/発表者名
      山内聡一郎,福田夏希,佐藤卓史,増田 豪,堀内正隆,小橋川敬博,大槻純男,森岡弘志
    • 学会等名
      第12回日本ケミカルバイオロジー学会年会
  • [学会発表] 高品質な一本鎖抗体の創製に向けた物理化学的手法による評価2017

    • 著者名/発表者名
      森岡弘志
    • 学会等名
      第3回蛋白質工学研究会ワークショップ
    • 招待講演
  • [学会発表] 高品質な一本鎖抗体の創製と血清AGE修飾タンパク質の解析2017

    • 著者名/発表者名
      森岡弘志
    • 学会等名
      第49回若手ペプチド夏の勉強会
    • 招待講演
  • [学会発表] NMR解析に向けた終末糖化産物の1種であるGA-pyridineに対する一本鎖抗体(scFv)の創製2017

    • 著者名/発表者名
      翁 力棟,宮﨑広海,分山結加里,中原悠介,福田夏希,佐藤卓史,小橋川敬博,森岡弘志
    • 学会等名
      第41回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム
  • [学会発表] 終末糖化産物GA-pyridineに対する一本鎖抗体の抗原特異性と親和性の評価2017

    • 著者名/発表者名
      森田光佑,小谷俊介,中島 誠,福田夏希,佐藤卓史,小橋川敬博,森岡弘志
    • 学会等名
      2017年度 生命科学系学会合同年次大会(第40回日本分子生物学会年会、第90回日本生化学会大会)ConBio2017
  • [学会発表] 一本鎖抗体融合分子を用いた血清AGEs修飾タンパク質の分離・濃縮法の開発2017

    • 著者名/発表者名
      福田夏希,山内聡一郎,早野 翼,佐藤卓史,増田 豪,堀内正隆,小橋川敬博,大槻純男,○森岡弘志
    • 学会等名
      2017年度 生命科学系学会合同年次大会(第40回日本分子生物学会年会、第90回日本生化学会大会)ConBio2017
  • [備考] 熊本大学 大学院生命科学研究部 生命分析化学分野

    • URL

      http://seimeibunseki.org

  • [産業財産権] 終末糖化産物に対する抗体およびその使用2017

    • 発明者名
      竹内 正義,山本 哲郎,土田 仁美,森岡 弘志,山内 聡一郎
    • 権利者名
      竹内 正義,山本 哲郎,土田 仁美,森岡 弘志,山内 聡一郎
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願2017-168387

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公開日: 2021-01-27  

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