iPS細胞由来の神経移植で難治性てんかんを治療する

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K15532
• 研究機関: 福岡大学
• 研究代表者: 廣瀬 伸一 福岡大学, 医学部, 教授 (60248515)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 小児神経 / てんかん / マウス / iPS細胞 / 実験動物

研究実績の概要

研究実績の概要
遺伝子変異を有する遺伝子改変動物にiPS細胞由来の神経細胞を移植し、難治性のてんかんの治療が可能か、検証するために、現在精神遅滞を伴う難治性てんかん（ドラベ症候群）のノックインマウスの二系統 (ナンセンス変異二種)をCRISPR/Cas9遺伝子編集法を使って作成中である。ドラベ症候群は中枢神経電位依存性ナトリウムチャネルのα１サブユニットをコードする遺伝子SCN1Aの変異による、てんかん性脳症である。SCN1Aの変異は現在までに1200程度報告されており、60％がナンセンス変異を始めとするtruncating 変異と呼ばれ、α１サブユニットの分子途絶を引き起こす。その他の多くはミスセンス変異であり、アミノ酸置換を引き起こす。最近の我々の研究により、ナンセンス変異によるドラベ症候群はミスセンス変異によるものに比べ、精神遅滞が早期に重度に起こることが明らかにされた。このため、今回のドラベ症候群のモデルマウスの作出にノンセンス変異二種類を選んだ。我々がすでに作出した、SCN1Aを含む染色体微小欠失を持つマウスでは、ヒトと同様のけいれんを来たし、早期突然死も観察されている。現在マウスＥＳ細胞にScn1a変異を導入して、ピューロマイシンによる薬物選択により、ＥＳ細胞のクローニング実施中である。
一方、アイソジェニックな人工“健常”iPS細胞および、人工“ドラベ症候群”細胞を作出することを見据え、ヒトドラベ症候群およびiPS細胞にTALEN遺伝子編集法を使い、対照健常者由来のiPS細胞にSCN1Aの変異を導入、またドラベ症候群由来の患者iPS細胞のSCN1Aの変異の修復が終了し、論文として発表した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

現在マウスＥＳ細胞にScn1a変異を導入して、ピューロマイシンによる薬物選択により、ＥＳ細胞のクローニングの実施を続けているが、未だ陽性のクローンが拾えず、この段階で時間がかかっている。
一方、アイソジェニックな人工“健常”iPS細胞および、人工“ドラベ症候群”細胞を作出しそれらの論文を発表し、現在さらなる論文を投稿中である。以上から、当初の計画に比べやや遅れていると自己評価した。

今後の研究の推進方策

作出が成功したマウスの皮膚より皮膚線維芽細胞を作製し、エピソーマルベクターでOct 3/4,Sox 2, c-Myc, Klf 4を導入しiPS細胞を作製する。変異型iPS細胞に対してすでに実施経験のあるTALEN技術で変異型ナトリウムチャネル遺伝子Scna1A遺伝子を正常型に修正する。この時、マーカーとしてDsRed蛍光蛋白配列を付加する。変異を残したものも作成する。移植後の細胞の腫瘍化を防ぐため以下の前処置をおこなう。まずiPSをニューロスフェアーまで一旦分化させる。続いて、機能不全になりドラベ症候群の原因となるGABA系神経細胞を、GABAB受容体１、２などを利用して、セルソーターで分離する。短時間の培養ののち、脳内へ移植をおこなう。移植部位として、側脳室、視床、尾状核、海馬を候補とする。移植部位と分化状態の条件設定を行うため、移植後5,10,15,20,25,30日で脳切片を作りDsRedを標的に部位と接着を確認する作業を繰り返し、最適条件を決定する。移植神経細胞は、変異を編集により矯正した正常iPS細胞と変異を残したまままの変異iPS細胞（Mock）から、調整した神経細胞を用いる。これによって、変異iPS細胞から調整した神経細胞を移植した動物が変異以外同じ遺伝子をもつiPS細胞由来神経細胞を移植された動物が対照となる。（isogenic control）効果比較のため、行動観察も同時に実施する。とくにドラベ症候群モデル動物は体温上昇で容易にけいれんが誘発されるのが、特徴的であり、熱感受性発作の起こらないマウスは容易に治療効果があったと判断できる。また脳波の改善を確認すると同時に他の異常行動などの表現型も観察するため、２４時間ビデオ脳波にて、対照動物とともに観察を行い治療効果を判定する

研究成果

• [雑誌論文] Generation of D1-1 TALEN isogenic control cell line from Dravet syndrome patient iPSCs using TALEN-mediated editing of the SCN1A gene. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Y, Sone T, Higurashi N, Sakuma T, Suzuki S, Ishikawa M, Yamamoto T, Mitsui J, Tsuji H, Okano H, Hirose S.
  • 雑誌名: Stem Cell Res. 巻: 28 ページ: 100-4
  • DOI: 10.1016/j.scr.2018.01.036
  • 査読あり
• [雑誌論文] Somatic mosaic deletions involving SCN1A cause Dravet syndrome. (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakayama T, Ishii A, Yoshida T, Nasu H, Shimojima K, Yamamoto T, Kure S, Hirose S.
  • 雑誌名: Am J Med Genet A. 巻: 176(3) ページ: 657-62
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.38596
  • 査読あり
• [雑誌論文] Long-term follow up of an adult with alternating hemiplegia of childhood and a p.Gly755Ser mutation in the ATP1A3 gene. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ito T, Narugami M, Egawa K, Yamamoto H, Asahina N, Kohsaka S, Ishii A, Hirose S, Shiraishi H.
  • 雑誌名: Brain Dev. 巻: 40(3) ページ: 226-8
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2017.11.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] CACNA1A-related early-onset encephalopathy with myoclonic epilepsy: A case report. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hayashida T, Saito Y, Ishii A, Yamada H, Itakura A, Minato T, Fukuyama T, Maegaki Y, Hirose S.
  • 雑誌名: Brain Dev. 巻: 40(2) ページ: 130-3
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2017.08.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Variant Intestinal-Cell Kinase in Juvenile Myoclonic Epilepsy. (2018)
  • 著者名/発表者名: Bailey JN, de Nijs L, Bai D, Suzuki T, Miyamoto H, Tanaka M, Patterson C, Lin YC, Medina MT, Alonso ME, Serratosa JM, Duron RM, Nguyen VH, Wight JE, Martinez-Juarez IE, Ochoa A, Jara-Prado A, Guilhoto L, Molina Y, Yacubian EM, Lopez-Ruiz M, Inoue Y, Kaneko S, Hirose S, et al.
  • 雑誌名: N Engl J Med. 巻: 378(11) ページ: 1018-28.
  • DOI: 10.1056/NEJMoa1700175
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Abnormal gamma-aminobutyric acid neurotransmission in a Kcnq2 model of early onset epilepsy. (2017)
  • 著者名/発表者名: Uchida T, Lossin C, Ihara Y, Deshimaru M, Yanagawa Y, Koyama S, Hirose S.
  • 雑誌名: Epilepsia. 巻: 58(8) ページ: 1430-9.
  • DOI: 10.1111/epi.13807
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Two mild cases of Dravet syndrome with truncating mutation of SCN1A. (2017)
  • 著者名/発表者名: Takaori T, Kumakura A, Ishii A, Hirose S, Hata D.
  • 雑誌名: Brain Dev. 巻: 39(1) ページ: 72-4
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2016.07.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] A de novo missense mutation in SLC12A5 found in a compound heterozygote patient with epilepsy of infancy with migrating focal seizures. (2017)
  • 著者名/発表者名: Saito T, Ishii A, Sugai K, Sasaki M, Hirose S.
  • 雑誌名: Clin Genet. 巻: 92(6) ページ: 654-8
  • DOI: 10.1111/cge.13049
• [雑誌論文] Integrative Approach with Electrophysiological and Theoretical Methods Reveals a New Role of S4 Positively Charged Residues in PKD2L1 Channel Voltage-Sensing. (2017)
  • 著者名/発表者名: Numata T, Tsumoto K, Yamada K, Kurokawa T, Hirose S, Nomura H, Kawano M, Kurachi Y, Inoue R, Mori Y.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 7(1) ページ: 9760.
  • DOI: 10.1038/s41598-017-10357-3
• [雑誌論文] Clinical implications of SCN1A missense and truncation variants in a large Japanese cohort with Dravet syndrome. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Watkins JC, Chen D, Hirose S, Hammer MF.
  • 雑誌名: Epilepsia 巻: 58(2) ページ: 282-90.
  • DOI: 10.1111/epi.13639
  • 国際共著
• [雑誌論文] A de novo missense mutation of GABRB2 causes early myoclonic encephalopathy. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Kang JQ, Schornak CC, Hernandez CC, Shen W, Watkins JC, Macdonald RL, Hirose S.
  • 雑誌名: J Med Genet. 巻: 54(3) ページ: 202-11.
  • DOI: 10.1136/jmedgenet-2016-104083
  • 国際共著
• [雑誌論文] New Genes for Epilepsy - Autism Comorbidity. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Hirose S.
  • 雑誌名: J Pediatr Neurol. 巻: 15 ページ: 105-14.
  • DOI: 10.1055/s-0037-1602822
• [雑誌論文] Vagus nerve stimulation for genetic epilepsy with febrile seizures plus (GEFS+) accompanying seizures with impaired consciousness. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hanaya R, Niantiarno FH, Kashida Y, Hosoyama H, Maruyama S, Otsubo T, Tanaka K, Ishii A, Hirose S, Arita K.
  • 雑誌名: Epilepsy Behav Case Rep. 巻: 7 ページ: 16-9.
  • DOI: 10.1016/j.ebcr.2016.11.001
  • 国際共著
• [雑誌論文] Rare variants of small effect size in neuronal excitability genes influence clinical outcome in Japanese cases of SCN1A truncation-positive Dravet syndrome. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hammer MF, Ishii A, Johnstone L, Tchourbanov A, Lau B, Sprissler R, Hallmark B, Zhang M, Zhou J, Watkins J, Hirose S.
  • 雑誌名: PLoS ONE. 巻: 12(7) ページ: e0180485.
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0180485
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Genetics of epileptic encephalopathy. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirose S.
  • 学会等名: 4th National Conference of Society for Indian Academy of Medical Genetics(SIAMG)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] The potential of stem cells in precision medicine. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirose S.
  • 学会等名: 32nd International Epilepsy Congress.
  • 国際学会
• [学会発表] Effects of steroid pulse therapy in autoimmune childhood epilepsy with anti-glutamate receptor antibodies. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi H, Watanabe E, Ihara Y, Tomonoh Y, Fujita T, Ideguchi H, Inoue T, Takahashi Y, Yasumoto S, Hirose S.
  • 学会等名: CNSP-PLAE Symposium on Status Epilepticus & 9th National Epilepsy Congress.
  • 国際学会
• [学会発表] Status epilepticus in genetic epilepsies. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirose S, Ishii A.
  • 学会等名: CNSP-PLAE Symposium on Status Epilepticus & 9th National Epilepsy Congress.
  • 国際学会
• [学会発表] Voltage-Gated sodium Ion Channels in Epileptic Encephalopathy. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirose S.
  • 学会等名: 14th Asian and Oceanian Congress of Child Neurology.
  • 国際学会
• [学会発表] A de novo missense mutation of GABRB2 causes early myoclonic encephalopathy. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Hirose S
  • 学会等名: 14th Asian and Oceanian Congress of Child Neurology.
  • 国際学会
• [学会発表] The effectiveness of steroid pulse therapy and prognosis in frontal lobe epilepsy with anti-glutamate receptor antibodies:a case report. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ihara Y, Tomonoh Y, Fujita T, Ideguchi H, Inoue T, Takahashi Y, Yasumoto S, Hirose S.
  • 学会等名: 14th Asian and Oceanian Congress of Child Neurology.
  • 国際学会
• [学会発表] Efficacy of Levetiracetam monotherapy in epilepsy. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ideguchi H, Ihara Y, Fujita T, Inoue T, Hirose S.
  • 学会等名: 14th Asian and Oceanian Congress of Child Neurology.
  • 国際学会
• [学会発表] ACTH induced nonconvulsive status epilepticus in an infant with West Syndrome. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fujita T, Ideguchi H, Watanabe E, Tomonoh Y, Ihara Y, Inoue T, Hirose S, Yasumoto S
  • 学会等名: 14th Asian and Oceanian Congress of Child Neurology.
  • 国際学会
• [学会発表] Effects of steroid pulse therapy in refractory epilepsy with anti-glutamate receptor antibodies (2017)
  • 著者名/発表者名: Watanabe E, Ihara Y, tomonoh Y, Fujita T, Ideguchi H, Inoue T, Takahashi Y, Yasumoto S, Hirose S
  • 学会等名: 14th Asian and Oceanian Congress of Child Neurology.
  • 国際学会
• [学会発表] Application of induced pluripotent stem (iPS) cells in intractable childhood disorders. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirose S
  • 学会等名: 10th Annual World Congress on Pediatrics, Pediatric Gastroenterology and Nutrition
  • 国際学会
• [図書] Acute Encephalopathy and Encephalitis in Infancy and Its Related Disorders. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ishii A, Hirose S.
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: Elsevier: USA
• [図書] 稀少てんかんの診療指標 (2017)
  • 著者名/発表者名: 石井敦士、廣瀨伸一
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: 診断と治療社
• [図書] 稀少てんかんの診療指標 (2017)
  • 著者名/発表者名: 日暮憲道、廣瀨伸一
  • 総ページ数: 3
  • 出版者: 診断と治療社
• [図書] 遺伝医学MOOK別冊 最新精神・神経遺伝医学研究と遺伝カウンセリング (2017)
  • 著者名/発表者名: 石井敦士、廣瀨伸一
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 株式会社メディカルドゥ