研究課題
放射線治療法の高精度化にもかかわらず、がんは治療後にしばしば再発し、患者の生命を脅かす。この問題を克服する為に本研究で我々は、ヒトの全遺伝子の中から強力にがん細胞の放射線抵抗性を誘導する遺伝子を網羅的に探索することを目的に据え、以下の研究成果を得た。まず、cDNA発現ライブラリーを導入したがん細胞に致死線量の放射線を照射し、生存して来たコロニーからcDNAをレスキューするという手法で、放射線抵抗性に関わる遺伝子を網羅的にスクリーニングする系を確立した。そしてこれまで細胞の放射線抵抗性・感受性との関わりが全く報告されていない遺伝子を含む複数の遺伝子を、放射線抵抗性を亢進する候補遺伝子として同定することに成功した。ヒト子宮頸がん由来がん細胞株HeLaのtotal RNAを精製後、これを鋳型に逆転写反応を行うことで、各遺伝子のcDNAを獲得した。各cDNA断片の両端にリンカー配列を付加した後、mammalian細胞用発現プラスミドpcDNAに組み込むことで、各候補遺伝子の発現ベクターを構築した。このベクターを安定に組み込んだがん細胞株に放射線を照射し、Clonogenic Cell Survival Assay（コロニー形成試験）などの放生戦生物学的実験を実施することで、幾つかの候補遺伝子が予想に違わず細胞の放射線抵抗性を亢進することを確認した。各遺伝子が放射線抵抗性を亢進するメカニズムに迫るため、各種レポーターアッセイ系や、免疫沈降法などを最適化し、以降の研究に備えた。
2: おおむね順調に進展している
既に、細胞の放射線抵抗性にかかわる遺伝子を複数クローニングすることに成功し、その機能を確認し終えたため。
本研究で同定した各遺伝子が放射線抵抗性を亢進する機序を解明する目的で、分子細胞生物学的実験を実施する。まず申請者が構築したDNA損傷部位を可視化するレポーター遺伝子を活用して、本研究で同定した遺伝子がDNA損傷修復能を有するか否かを一つ一つ検証する。またメタボローム実験を通して、抗酸化作用を持つ代謝産物の量が各遺伝子の過剰発現によって増加するかを検証する。さらに、各遺伝子が抗アポトーシス活性を持つかをDNAラダー定量実験で検証する。各遺伝子が何れの活性も示さなかった場合には、各遺伝子の過剰発現によって発現量が変動する遺伝子をマイクロアレイ法で探索し、放射線抵抗性を亢進する新たな機序に迫る。また、各遺伝子を過剰発現したがん細胞とノックダウンしたがん細胞を遺伝子工学的に樹立し、その移植腫瘍を対象に放射線治療実験を実施する。そして各遺伝子が腫瘍組織レベルの放射線抵抗性を亢進するかを検証する。さらに、公開されているマイクロアレイ・データベースを利用して、各遺伝子の発現量とがん患者の生命予後不良が相関する可能性を検証する。また各遺伝子に対する抗体を利用して臨床検体を対象に免疫組織化学染色実験を実施し、各遺伝子産物の発現量と予後不良の相関を検証する。そして各遺伝子を治療標的とする臨床的意義や予後予測マーカーとしての有用性を検証する。
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Cancer Medicine
巻: 6 ページ: 288-297
10.1002/cam4.991
Scientific Reports
巻: 6 ページ: 34424
10.1038/srep34424
Oncotarget
巻: 7 ページ: 65837-65848
10.18632/oncotarget.11670
Tumor Biology
巻: 37 ページ: 13295-13306
10.1007/s13277-016-5260-2
J Radiat Res
巻: 57 ページ: 99-105
10.1093/jrr/rrw012
Clin Exp Metastasis
巻: 33 ページ: 87-95
10.1007/s10585-015-9760-z
Radiology
巻: 278 ページ: 734-741
10.1148/radiol.2015150416
Oncogene
巻: 35 ページ: 793-799
10.1038/onc.2015.134
http://radiotherapy.kuhp.kyoto-u.ac.jp/biology/index.html
