大腸癌細胞クラスター形成機構の解明と新規抗癌転移治療法への応用

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K15598
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 五藤 倫敏 順天堂大学, 医学部, 非常勤講師 (50445532)
• 研究分担者: 小見山 博光 順天堂大学, 医学部, 非常勤講師 (30348982) ; 折茂 彰 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (70275866)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 大腸癌 / 癌細胞クラスター / EMT（上皮間葉移行） / 浸潤・転移 / E-cadherin / tumor organoid

研究実績の概要

Epithelial-mesenchymal transition（EMT）仮説が現状では普及されているが、患者癌組織においてEMTの存在は懐疑的でありかつEMTを介した単一細胞が転移形成に寄与する直接的証拠はない。申請者は９例の外科的に切除された患者大腸癌組織を使用したpatient-derived tumor xenograft (PDX)モデルを樹立し、癌細胞クラスター形成が転移に必須であることを示唆した。また、研究代表者らの先行研究および他者の研究より細胞接着因子のE-cadherinが大腸癌細胞クラスター形成に必須であることが示唆されていた。
そこで、本研究ではE-cadherinの中和抗体やshRNAを作製した。患者大腸癌由来PDXより培養大腸癌organoidを樹立し、これらのE-cadherin抑制剤を投与したところ、癌クラスター形成を有意に阻害した。さらにE-cadherinの癌クラスター形成能が転移形成に寄与しているか否かを検討した。対照群のランダム配列を認識するshRNAが導入された大腸癌organoidと比較して、shRNAでE-cadherinの発現が抑制された大腸癌organoidは、免疫不全マウスの門脈に注入された時、有意に肝臓における転移形成を抑制した。
以上の結果よりE-cadherinは大腸癌organoidのクラスター形成に必須であり、転移のコロニー形成能を媒介することが示唆された。
しかしながら、E-cadherinの抑制は正常上皮細胞の細胞―細胞接着を媒介している可能が示唆されている故、重篤な副作用が危惧される。今後は、癌細胞特異的に細胞―細胞接着を抑制するseedの取得が必要があると考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

患者大腸癌組織をＮＯＧマウスに移植しＰＤＸモデルを作製し，E-cadherin陽性の血中循環癌細胞クラスターの形成を確認した。患者大腸癌組織よりin vitro organoid培養を施行しＮＯＧマウスに同所移植したところ、E-cadherin陽性の血中循環癌細胞クラスターの形成が確認された。さらにE-cadherinの癌クラスター形成能が転移形成に寄与しているか否かを検討する実験を行った．対照群のランダム配列を認識するshRNAが導入された大腸癌organoidと比較して、shRNAでE-cadherinの発現が抑制された大腸癌organoidは、免疫不全マウスの門脈に注入された時、有意に肝臓における転移形成を抑制した。以上の結果よりE-cadherinは大腸癌organoidのクラスター形成に必須であり、転移のコロニー形成能を媒介することが示唆されており，本研究課題が順調に進捗していると判断した。

今後の研究の推進方策

効率的なスクリーニングを目指し、現在、安定して大腸癌organoids培養系の確立の為の条件検討を行ってきた．大腸癌organoids培養系を用いて、high through-put screening を計画している。３X102 大腸癌organoidsを96 well plate にMatrigelコート上にまき、化合物ライブラリ―を添加して、organoids形成の過程を生細胞イメージングシステムを用いてモニターする。すでにE-cadherinが大腸癌organoidのクラスター形成に必須であり、転移のコロニー形成能を媒介すること，E-cadherinの抑制が正常上皮細胞の細胞―細胞接着を媒介している可能が示唆されている．今後は本研究で得た知見の臨床応用に向けて癌細胞特異的に細胞―細胞接着を抑制するseedの取得も検討しつつ研究を進めていく。

次年度使用額が生じた理由

上記の患者大腸癌検体の移植後のマウスにおける癌増殖の遅延や、血中循環癌細胞が非常に低頻度に検出されることにより、必要な免疫組織染色等の実験量が予想より増えため、時間を要し，予定資材購入の一部を次年度に繰り越した．
効率的なスクリーニングを目指し、現在、安定して大腸癌organoids培養系の確立の為の条件検討を行ってきたが，H30年度はさらに大腸癌organoids培養に必要な資材の追加購入により，実験を進めていく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Survival benefit of lymph node dissection in surgery for colon cancer in elderly patients: A multicenter propensity score-matched study in Japan. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Niitsu H, Sakamoto K, Hinoi T, Hattori M, Goto M, Bando H, Hazama S, Maeda K, Okita K, Horie H, Watanabe M; Japan Society of Laparoscopic Colorectal Surgery.
  • 雑誌名: Asian J Endosc Surg. 巻: 11 ページ: 346-354.
  • DOI: 10.1111/ases.12474
• [雑誌論文] The impact of stromal Hic-5 on the tumorigenesis of colorectal cancer through lysyl oxidase induction and stromal remodeling. (2018)
  • 著者名/発表者名: Omoto T, Kim-Kaneyama JR, Lei XF, Orimo A, Ohnishi K, Yoshihara K, Miyauchi A, Li S, Gao L, Umemoto T, Tanaka J, Nakahara K, Takeya M, Ishida F, Kudo SE, Haraguchi S, Miyazaki T, Miyazaki A.
  • 雑誌名: Oncogene 巻: 37(9) ページ: 1205-1219
  • DOI: 10.1038/s41388-017-0033-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Microenvironmental control of breast cancer subtype elicited through paracrine platelet-derived growth factor-CC signaling. (2018)
  • 著者名/発表者名: Roswall P, Bocci M, Bartoschek M, Li H, Kristiansen G, Jansson S, Lehn S, Sjölund J, Reid S, Larsson C, Eriksson P, Anderberg C, Cortez E, Saal LH, Orsmark-Pietras C, Cordero E, Haller BK, Häkkinen J, Burvenich IJG, Lim E, Orimo A, Höglund M, Rydén L, Moch H, Scott AM, Eriksson U, Pietras K.
  • 雑誌名: Nat Med 巻: 24(4) ページ: 463-473
  • DOI: 10.1038/nm.4494
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pharmacological targeting of neutrophil serine proteases prevents lethality in dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice (2018)
  • 著者名/発表者名: Ro H, Munakata S, Ueyama T, Komiyama H, Takahashi M, Kojima Y, Tomiki Y, Sakamoto K
  • 雑誌名: Journal of Gastrointestinal & Digestive System 巻: 8 ページ: --
  • DOI: 10.4172/2161-069X.1000551
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Salivary chromogranin a as a psychosomatic stress marker is suppressed in laparoscopic surgery compared with open surgery for colon cancer. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ishiyama S, Sakamoto K, Kamiyama H, Niwa K, Sugimoto K, Takahashi M, KojimaY, Goto M, Okuzawa A, Tomiki Y
  • 雑誌名: Juntendo Medical Journal 巻: 63 ページ: 88-94
  • DOI: Juntendo Medical Journal
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Propensity score analysis in the comparison of long-term outcomes for locally advanced colon cancer. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sugimoto K, Sakamoto K, Ichikawa R, Kure K, Honjo K, Ro H, Takahashi R, Kawano, Niwa K, Ishiyama S, Kamiyama H, Komiyama H, Takahashi M, Kojima Y, Goto M, Okuzawa A, Ishibiki Y, Tomiki Y
  • 雑誌名: Juntendo Medical Journal 巻: 63 ページ: 264-272
  • DOI: 10.14789/jmj.63.264
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Combination of glycopyrronium and indacaterol inhibits carbachol-induced ERK5 signal in fibrotic processes (2017)
  • 著者名/発表者名: Namba Y, Togo S, Tulafu M, Kadoya K, Nagahama KY, Taka H, Kaga N, Orimo A, Liu X, Takahashi K.
  • 雑誌名: Respir Res 巻: 18(1):46 ページ: 1-13
  • DOI: 10.1186/s12931-017-0529-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 癌内線維芽細胞と癌悪性化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 折茂彰
  • 学会等名: 第836回千葉県がんセンター研究所集談会
  • 招待講演
• [学会発表] 癌内線維芽細胞の癌悪性化機構の解明および治療標的としての展望 (2018)
  • 著者名/発表者名: 折茂彰
  • 学会等名: 公益財団法人微生物化学研究会セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] Semaphorin 3C has a possibility of a new prognostic marker in colorectal cancer. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kawano S, Komiyama H, Goto M, Sakamoto K
  • 学会等名: 110th AACR, Washington DC,
  • 国際学会
• [学会発表] Postoperative adjuvant chemotherapy improves survival in stage II colon cancer ? a propensity score matching analysis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsukamoto R, Matsuzawa M, Hagiwara T, Tsuchiya Y, Amemiya K, Motegi S, Makino Y, Kawano S, Honjo K, Kure K, Ichikawa R, Ro H, Ito S, Takahashi R, Niwa K, Ishiyama S, Sugimoto K, Kamiyama H, Takahashi M, Kojima Y, Goto M, Okuzawa A, Tomiki Y, Fukunaga T, Kajiyama Y, Kawasaki S, Sakamoto K:
  • 学会等名: 110th AACR, Washington DC
  • 国際学会
• [学会発表] Identification of a novel diagnostic marker for colon cancer through comprehensive microRNA analysis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsukamoto R, Komiyama H, Hosoya M, Kure K, Okazawa Y, Mizukoshi K, Fukaya M, Sugimoto K, Kamiyama H, Tomiki Y, Sakamoto K:
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会 横浜
• [学会発表] Carcinoma-associated fibroblasts upregulate endoglin expression to mediate their activated myofibroblastic traits. (2017)
  • 著者名/発表者名: Okubo S, Mezawa Y, Ito Y, Watanabe s, Hino O, Orimo A
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会v横浜
• [学会発表] CAFs boost mammary cancer invasion and metastasis via formation of the epithelial and mesenchymal tumor cell cluster. (2017)
  • 著者名/発表者名: Akira Orimo, Yasuhiko Ito, Yoshihiro Mezawa, Kaidiliavi Sulidan, Nadila Wali1, Okio Hino, Kazuyoshi Takeda, Michiaki Hamada, Yuko Matsumura
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [学会発表] Carcinoma-associated fibroblasts attenuate CD26/dipeptidyl peptidase-4 expression via activation of the TGF-β-Smad2/3pathway. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Mezawa, Chikao Morimoto, Okio Hino, and Akira Orimo
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [学会発表] Carcinoma-associated fibroblasts promote metastatic seeding of the highly epithelial human breast carcinoma cell cluster with a quasi-mesenchymal trait. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yasuhiko Ito, Yuko Matsumura, Yoshihiro Mezawa, Kaidiliavi Sulidan, Nadila Wali, Yasuhiko Terao, Satoru Takeda, Ko Okumura, Kazuyoshi Takeda, Okio Hino, Akira Orimo
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [学会発表] Production of monoclonal antibodies against amino acid transporter SLC7A1 to develop novel therapy for colorectal cancer. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukaya M, Komiyama H, Sugimoto K, Kamiyama H, Sakamoto K:
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [学会発表] Identification of a novel diagnostic marker for colon cancer through comprehensive microRNA analysis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsukamoto R, Komiyama H, Hosoya M, Kure K, Okazawa Y, Mizukoshi K, Fukaya M, Sugimoto K, Kamiyama H, Tomiki Y, Sakamoto K:
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [備考] 順天堂大学大学院 下部消化管外科学 （消化器外科学講座）
  • URL: https://www.juntendo.ac.jp/graduate/laboratory/labo/kabusyoukakan/