| 研究課題/領域番号 |
16K15719
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
伊木 健浩 京都大学, 医学研究科, 特定病院助教 (20755649)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | otosphereの作成 / solid type / マイクロアレイ / トランスクリプトーム / GO解析 / 転写因子の抽出 |
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| 研究実績の概要 |
〇適切なotosphereの作成、回収
ICRマウスの蝸牛細胞を単離培養し、otosphereを作成した。otosphereのうち、solid typeは前駆/幹細胞を含有するが、培養中前駆/幹細胞を喪失したhollow typeに形態変化することがある。マイクロアレイ解析を行うにあたり、hollow typeを混入防止のため、hollow typeが増殖しない培養条件および除去する方法を検討したところ、1回の継代を挟み8日間の維持培養が妥当であった。また培養するに従い、両者のサイズの違いが鮮明となり、セルストレイナーで分離可能であった。その結果、90%以上の純度でsolid typeのotosphereを回収することが可能となった。
〇蝸牛由来の前駆/幹細胞における遺伝子発現の網羅的解析
otosphereサンプルを6回にわたり回収し、ES細胞、コルチ器、MEFを比較サンプルとして、RNAを抽出しマイクロアレイを行った。マイクロアレイより得られた結果は研究協力者である田中が解析した。クラスタリング解析でotosphereサンプル同士の異質性が少ないことが確認された。マイクロアレイ解析の妥当性を検討するために、代表となる約50の遺伝子に対し、qPCRで遺伝子発現を調べ、いずれもマイクロアレイ解析の結果と矛盾しなかった。
〇候補転写因子の抽出
GO解析で"transcription, DNA-binding, DNA-dependent"のannotationを有する遺伝子を転写因子と考えて、候補転写因子の抽出を行った。発現量においてotosphere>ES細胞、otosphere>コルチ器、otosphere>MEFをそれぞれ満たす転写因子をotosphereでの発現量が高い順に順位をつけ、3つのグループでつけられた順位を転写因子ごとに平均化する。平均化された順位を良いものから100個選択して、これらを候補転写因子とした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
可及的にsolid typeのotosphereのみを回収する必要があり、成長因子の種類、濃度といった培地の検討、培養日数の検討を要した。それでもhollow typeのotosphereは混在してくるため、分離法についての検討にも時間を要した。
マイクロアレイ解析の妥当性についてqPCRで検討を行ったが、約50の遺伝子に対するプライマー作成において、増幅効率が悪いなどの原因で数回配列の変更を余儀なくされたプライマーがあった。これによりqPCR施行回数の増大、特にotosphereサンプルの不足を招き、数ヶ月時間を割く必要があった。
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| 今後の研究の推進方策 |
〇direct conversionを行うための転写因子の絞り込み
候補となる転写因子を用いてiPS干渉法を行うため、iPS細胞にレトロウイルスでの転写因子の導入を試みる。pMXをバックボーンとするプラスミドベクターに個々の転写因子のORFをクローニングする予定である。iPS干渉法ではotosphereに転写因子とSox2、Oct3/4、Klf4、c-Mycの初期化4因子を導入する予定であるが、導入効率のばらつきを極力抑えるため、初期化4因子はendogeneousに発現するように工夫する。すなわちdoxycycline (Dox) 投与で4因子を発現するtet-onマウスの蝸牛からotosphereを作成して、転写因子を導入後、Doxを添加して、培養を行い、iPS細胞へと変化するか観察する。まずはマウスが手に入り次第、転写因子を導入しない場合のotosphereの初期化効率について確認する。
〇otosphereのcharacterの調査
マイクロアレイ解析により得られた遺伝子発現に関し、otosphere特異的なもの、ES細胞とotosphere共通に発現しているもの数種類を詳細に検討する。これはotosphereのマーカーとして役立つ可能性があり、direct conversionにより生じた細胞がotosphereを構成する細胞と判別しうる。また、ES細胞との比較でstemnessにかかわる遺伝子が見出せる可能性がある。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
発表がなかったため、旅費の使用がなかった。転写因子のDNA配列を搭載したプラスミドベクターに関する支出が今年度なかったことが主な原因である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記プラスミドベクターに関する購入資金として活用する。またotosphereのcharacterとマイクロアレイ解析の結果に関する学会発表および論文作成、発表を翌年度に計画しており、それらに助成金を充てる見込みである。
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