| 研究課題/領域番号 |
16K15736
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
森藤 暁 立命館大学, 立命館グローバル・イノベーション研究機構, 研究員 (20647234)
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| 研究分担者 |
本間 美和子 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (40192538)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | マウスES細胞 / 網膜細胞分化 / 視細胞 / ミトコンドリア / ３次元網膜 |
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| 研究実績の概要 |
福島県立医科大学から、立命館大学への異動にともない、まず、立命館大学へのマウスES細胞の再導入と細胞培養の立ち上げから開始した。昨年度に理研BRCから入手していた、マウスES細胞株Rx-GFPとEB5は、福島県立医科大学より持ってくることができなかったため、MTAを再度締結して、理研BRCから、マウスES細胞株Rx-GFPとEB5を購入し、立命館大学へ導入し、立命館大学で、マウスES細胞の維持培養および網膜分化培養などの立ち上げを実施した。昨年度は、ミトコンドリアの観察に適した２次元分化培養法として、シャーレ内で胚様体をマトリゲルで挟むことによる分化培養法を確立しているが、今年度は、より生体に近い分化培養法である既報の３次元網膜の分化培養法の導入を中心に行なった。当初の実験では、初期には効率よく網膜細胞への分化が見られたが、その後の成熟培養中に網膜以外の細胞の割合が多くなってしまい、３次元網膜の作製には至らなかった。このため、外部機関との共同研究により３次元網膜作製法の情報を入手し、立命館大学で、３次元網膜の分化培養を行ない、抗体染色により網膜層構造へ分化を確認することができたところである。視細胞のミトコンドリア解析を行なうため、当初は、レポーターノックイン系統を作る予定にしていたが、より信頼度が高いと考えられる、トランスジェニックマウスから作製された視細胞を蛍光ラベルできるマウスiPS細胞(Nrl-GFP）を入手して、研究を行なうことにした。現在、MTAの締結を終えたところであり、今後、桿体視細胞を蛍光ラベルできるNrl-GFP細胞を用いて、網膜細胞や３次元網膜への分化を行ない、ミトコンドリア染色によるFACSで、視細胞が濃縮できるかどうかの検討を行なっていく予定である。また、錐体視細胞をラベルするために、AAVを用いた検討も行なっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
異動により、昨年度購入したマウスES細胞を再度購入することが必要となり、再度、維持培養法と分化培養法の立ち上げることとなり、３次元網膜の分化培養法の導入に苦戦し、予定より時間がかかったため、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度、福島県立医科大学のときに、ヒトES/iPS細胞の未分化凝集塊をマトリゲルではさんで培養することで、効率的に網膜細胞への分化させることができるという論文をもとに、マウスES細胞から網膜細胞への分化させる方法を確立した。この方法は、分化細胞がシャーレの底面に２次元的に広がるため、ミトコンドリアの観察などには適しているが、３次元構造をとらないため、生体の網膜組織の状況を反映しているとは言いがたい。このため、今年度は、既報の３次元網膜の分化培養法の立ち上げを実施した。今後は、マウスES/iPS細胞からのこの２つの網膜細胞への分化法を用いて、視細胞のミトコンドリア解析を行なう。現在、桿体視細胞を蛍光ラベルできるマウスiPS細胞(Nrl-GFP）の入手のための手続きと錐体視細胞を蛍光ラベルできるAAVベクターの検討を行っており、これらの組み合わせで、視細胞のミトコンドリア解析と視細胞を濃縮できる培地成分の検討を行なっていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
異動により研究計画が遅れたために次年度使用額が生じた。次年度使用額のうち、３０万円程度については、マウスES/iPS細胞培養実験と分化実験関連の培地、試薬、器具に用いる。また、残りについては、FACS関連実験用の試薬やミトコンドリア染色試薬や抗体類の購入に使用する。
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