| 研究課題/領域番号 |
16K15736
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
森藤 暁 立命館大学, 薬学部, 助教 (20647234)
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| 研究分担者 |
本間 美和子 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (40192538)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 網膜 / 多能性幹細胞 / 分化 / ミトコンドリア |
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| 研究実績の概要 |
視細胞におけるミトコンドリア解析を進めるため、視細胞を蛍光ラベルできる多能性幹細胞として、共同研究先からマウスiPS細胞株であるNrl-GFP株を導入した。このNrl-GFP株を用いて、本研究により見出した網膜細胞への分化法を試したが、GFPの蛍光が確認できなかった。これまで用いていたRx-GFP株は、LIFのみを加えて培養していたが、Nrl-GFP株は、2i+LIFを加える培養という違いがある。2iとして加える阻害剤のうちの1つのCHIR99021は、Wntシグナルを活性化させることや、もう1つの阻害剤PD325901でDNAの低メチル化が誘導されることが報告されていることなどから、LIFのみの培養では、網膜細胞に分化したが、2i+LIF培養では、網膜細胞への分化が阻害された可能性があるのではないかと考えている。以上から、Nrl-GFP株を用いる解析では、本研究により見出した網膜細胞への分化法を使えないと判断した。このNrl-GFP株は、3次元網膜に分化誘導が可能であるため、Nrl-GFP株を3次元網膜に分化させ、ミトコンドリア蛍光色素TMRMを用いて染色をして、FACS解析を行ったところ、TMRM蛍光が強い集団が2つあり、そのうち1つはGFP陽性の集団であるため、Nrl-GFP陽性と考えられるrod photoreceptorは、ミトコンドリア量が多いと考えられた。今後は、このTMRM蛍光が強く、Nrl-GFP陽性でもある細胞集団を分取して培養し、解析を行うことを計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
大学での教育関連業務が増え、研究に費やせる時間が減少したことが第一の理由として挙げられる。また、視細胞がラベルされているiPS細胞株Nrl-GFPを導入し、本研究により見出した網膜細胞への分化法を試したが、GFPの蛍光が確認できなかったことも理由として挙げられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究により見出した網膜細胞への分化法は、導入した2i+LIF培養のNrl-GFPのiPS細胞株ではうまく行かなかったため、この分化法を用いるためには、LIF培養のES/iPS細胞である必要が考えられた。そこで、今後、LIF培養のEB5株やRx-GFP株を用いて、視細胞でミトコンドリア局在型の蛍光タンパク質を発現するようなES細胞株を作出したい。そして、この分化法で、視細胞を得て、継時的に視細胞のミトコンドリアを観察したり、培地成分を変えることで視細胞が濃縮できるかどうかの解析を行いたいと考えている。また、Nrl-GFP株を3次元網膜に誘導する実験系は可能であることがわかったため、この実験系でミトコンドリアを染める蛍光試薬であるTMRM染色を行い、TMRM陽性でNrl-GFP陽性でもある細胞集団を分取して培養し、解析を行うことも計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者の森藤暁が、立命館大学薬学部の助教に着任し、実習や一部の講義などの教育に関わる義務が増え、また、着任初年度ということもあり、研究に費やせる時間が減少したため、次年度使用額が生じた。次年度使用額については、マウスES細胞の培養と網膜細胞への分化に必要な培地や試薬の購入、視細胞でミトコンドリア局在型蛍光タンパク質を発現できるようなES細胞株の作出に必要な分子生物学実験関連試薬などへ使用を計画している。
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