McCune-Albright症候群からの疾患特異的iPS細胞の樹立とその応用

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K15791
• 研究機関: 東京歯科大学
• 研究代表者: 山口 朗 東京歯科大学, 歯学部, 客員教授 (00142430)
• 研究分担者: 小野寺 晶子 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90637662) ; 齋藤 暁子 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (90722835)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: McCune-Albright症候群 / 線維性骨異形成症 / GNAS1 / iPS細胞

研究実績の概要

McCune-Albright症候群（MAS）は、線維性異形成症(FD)、カフェオレ斑、思春期早熟症を主症状とする疾患で、GNAS1 exon8上のcodon 201の点変異によるGsαの恒常的活性化に起因する。MASの病変部は正常細胞および変異細胞との体細胞モザイクであることが知られており、変異細胞のみを得ることは非常に困難なので、本研究ではCRISPR / Cas9遺伝子編集技術を用いてヒト正常iPS細胞にGNAS1突然変異を導入し、MAS型ヒトiPS細胞の作製を試みた。遺伝子編集は以下の手順で行った。① 2か所のgRNA配列をCRISPR designを用いて選択した。② ①で選択したgRNAをpSpCas9n(BB) (PX460) ベクターに組み込んだ。③ ターゲティングベクターは薬剤耐性遺伝子を挟む形で5’ 側にexon7の相同領域を、3’側にはcodon 201アルギニンをヒスチジンに置換したexon 8-10を含む相同領域を設計した。④ ②および③で作製したベクターをエレクトロポレーションにより正常iPS細胞（NiPS）に導入し、薬剤選択培地で培養後、コロニーを単離した。その結果、得られたクローン24個中2個のクローンで、ゲノムDNAのGNAS1遺伝子変異を確認できた。得られたiPS細胞の未分化マーカー（REX1、NANOG、OCT3 / 4、SOX2 ）および三胚葉分化マーカー（AFP、SOX17、MSX1、BRACHYURY、MAP2、PAX6 ）の発現をRT-PCRを用いて確認し、MAS表現型を有する可能性を持つGNAS1変異iPS細胞の樹立に成功した。現在、ヒトFD患者病変部からのiPS細胞の樹立を行っており、今後、これらの細胞の骨芽細胞およびメラニン産生細胞へ分化誘導および解析を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Leukemia inhibitory factor produced by fibroblasts within tumor stroma participates in invasion of oral squamous cell carcinoma. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohata Y, Tsuchiya M, Hirai H, Yamaguchi S, Akashi T, Sakamoto K, Yamaguchi A, Ikeda T, Kayamori K
  • 雑誌名: PLos One 巻: 13 ページ: e0191865
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0191865.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Targeted reversion of induced pluripotent stem cells from patients with human cleidocranial dysplasia showed corrected osteoblastic differentiation both in vitro and in vivo. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ooki A, Nakamura T, Onodera S, Hayashi K, Hasegawa D, Kato H, Onda T, Watanabe A, Kosaki K, Nishimura K, Ohtaka M, Nakanishi M, Sakamoto T, Yamaguchi A, Sueishi K, Azuma T
  • 雑誌名: Stem Cell Res Ther 巻: 9 ページ: 12
  • DOI: 10.1186/s13287-017-0754-4
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The HIV co-receptor CCR5 regulates osteoclast function. (2017)
  • 著者名/発表者名: Lee JW, Hoshino A, Inoue K, Saito T, Uehara S, Kobayashi K, Ueha U, Matsushima M, Yamaguchi A, Imai Y, Iimura T
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 8 ページ: 2226
  • DOI: 10.1038/s41467-017-02368-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Gorlin syndrome-derived induced pluripotent stem cells are hypersensitive to Hedgehog-mediated osteogenic induction. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa D, Shino H, Onodera S, Nakamura T, Saito A, Onda T, Watanabe K, Nishimura K, Ohtaka M, Nakanishi M, Kosaki K, Yamaguchi A, Shibahara T, Azuma T
  • 雑誌名: PLos One 巻: 12 ページ: e0186879
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0186879
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Multi-layered mutation in hedgehog-related genes in Gorlin syndrome may affect the phenotype. (2017)
  • 著者名/発表者名: Onodera S, Saito A, Hasegawa D, Morita N, Watanabe K, Nomura T, Shibahara T, Ohba S, Yamaguchi A, Azuma T
  • 雑誌名: PLos One 巻: 12 ページ: e0184702
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0184702
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetic basis of calcifying cystic odontogenic tumors. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yukimori A, Oikawa Y, Morita K, Nguyen CTK, Harada H, Yamaguchi, S, Kayamori K, Yamaguchi A, Ikeda T, Sakamoto K
  • 雑誌名: PLos One 巻: 12 ページ: e0180224
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0180224
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Practical whole-tooth restoration utilizing autologous bioengineered tooth germ transplantation in a postnatal canine model. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ono M, Oshima M, Ogawa M, Sonoyama W, Hara ES, Oida Y, Shinkawa S, Nakajima R , Mine A, Hayano S, Fukumoto S, Kasugai S, Yamaguchi A, Tsuji T, Kuboki T
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 44522
  • DOI: 10.1038/srep44522
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The Bone Regeneration Model and Primary Osteoblastic Cell Culture Used in the Analysis of Ccn3 Transgenic and Knockout Mice (2017)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto K, Matsushita Y, Minamizato T, Katsuki Y, Katsube KI, Yamaguchi A
  • 雑誌名: Methods Mol Biol 巻: 1489 ページ: 309-324
  • 査読あり
• [雑誌論文] LAMC2 is a predictive marker for malignant progression of leukoplakia. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nguyen CTK, Okamura T, Morita K, Miki Y, Izumo T, Kayamori K, Yamaguchi A, Sakamoto K
  • 雑誌名: J Oral Pathol Med 巻: 46 ページ: 223-231
  • DOI: 10.1111/jop.12485
  • 査読あり
• [学会発表] THの骨形成促進作用における基礎研究の展開 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山口 朗
  • 学会等名: 第7回骨・軟骨フロンティア
  • 招待講演
• [学会発表] iPS 細胞を用いた顎骨疾患病態解明へのアプローチ (2017)
  • 著者名/発表者名: 東 俊文、小野寺晶、齋藤 暁子、中村 貴、大庭 伸介、小崎健次郎、 山口 朗、柴原 孝彦
  • 学会等名: 第５９回歯科基礎医学会総会学術大会アップデートシンポジウム
  • 招待講演
• [図書] 最新口腔外科学 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山口 朗、栢森高
  • 総ページ数: 67-70
  • 出版者: 医歯薬出版株式会社