ヒトiPS化の際の染色体リプログラミングを制御するタンパク質分解経路の同定

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K15811
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 犬塚 博之 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (20335863)
• 研究分担者: 福本 敏 東北大学, 歯学研究科, 教授 (30264253) ; 福島 秀文 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (70412624)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: SKP2 / iPS細胞 / 蛋白質分解 / ユビキチン-プロテアソーム系

研究実績の概要

iPS化の際の、細胞周期調節ならびに染色体リプログラミングに重要と考えられるSKP2の相互作用分子、特にSKP2上流E3ユビキチンリガーゼの同定のためのスクリーニングを行った。はじめに小麦胚芽無細胞発現系を用いて調整された230種類のRING-type E3ユビキチンリガーゼとSKP2の両抽出液を混合し、SKP2とライブラリー個々の分子間の結合シグナル強度を指標としてSKP2上流E3リガーゼの探索を行った。結合強度の比較から上位10クローンを選別し、それらを哺乳動物細胞発現ベクターに組み込んでHAタグ化し、SKP2発現プラスミドとともに個別に293T細胞内に共発現させた。共免疫沈降による解析から、選抜された10クローン中およそ半数のクローンにおいて、導入された293T細胞内でSKP2との相互作用が確認された。得られたポジティブクローンをさらに絞り込むため、293T細胞一過性発現系でSKP2蛋白質分解・ユビキチン化の両アッセイを行い、得られた解析結果から、最も確度が高いRING#6をSKP2上流E3ユビキチンリガーゼ候補分子として選定し、その後の解析に供することとした。RING#6ノックダウン細胞を用いた解析から、ノックダウン細胞内においてSKP2蛋白質量の増加とSKP2蛋白質半減期の延長を確認した。さらに、RING#6により認識を受けるSKP2内のデグロン配列の同定を目的として、SKP2をN/C両末端から段階的に削りこんだSKP2変異体を用いて共免疫沈降を行った結果、RING#6はSKP2のN末端側90アミノ酸の領域を認識してSKP2ユビキチン化を行っていることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初年度目標として設定した、(1)SKP2と相互作用するE3リガーゼ分子の同定、(2)SKP2の上流E3リガーゼによるSKP2蛋白質分解の分子メカニズムの解析、の両項目において良好な解析結果を得ることが出来た。

今後の研究の推進方策

同定したSKP2新規相互作用分子によるSKP2蛋白質安定性調節がiPS化をどのように制御しているかについて、その分子機構の解析を行う。得られた知見をもとに、SKP2分解調節シグナルの任意制御を試み、効率的iPS化の可能性についての検討を併せて行う。

次年度使用額が生じた理由

初年度の実験計画は分子生物学的・生化学的な解析が主であり、高額な消耗品の購入による物品費の使用を抑えることが出来た。

次年度使用額の使用計画

次年度に計画しているiPS細胞の培養実験に係る購入経費（培地、血清、サプリメント、培養器具、遺伝子導入試薬等）に充当する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] Beth Israel Deaconess Medical Center(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Beth Israel Deaconess Medical Center
• [雑誌論文] G1 cyclins link proliferation, pluripotency and differentiation of embryonic stem cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Lijun Liu, Wojciech Michowski, Hiroyuki Inuzuka, Kouhei Shimizu, Naoe Taira Nihira, Joel M. Chick, Na Li, Yan Geng, Alice Y. Meng, Alban Ordureau, Aleksandra Kolodziejczyk, Keith L. Ligon, Roderick T. Bronson, Kornelia Polyak, J. Wade Harper, Steven P. Gygi, Wenyi Wei, Piotr Sicinski
  • 雑誌名: Nature Cell Biology 巻: 19 ページ: 177-188
  • DOI: doi:10.1038/ncb3474
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] BHD症候群関連タンパク質FNIP2のプロテアソーム依存的な量的調節機構の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 綿引 麻美、星川 聖良、犬塚 博之、江草 宏、福島 秀文
  • 学会等名: 第39回 日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02