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2016 年度 実施状況報告書

凍結細胞スフィアを用いた簡便な新規in vitro毒性評価系評の確立

研究課題

研究課題/領域番号 16K15815
研究機関松本歯科大学

研究代表者

各務 秀明  松本歯科大学, 歯学部, 教授 (80242866)

研究分担者 李 憲起  松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (60350831)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2018-03-31
キーワード凍結保存 / 線維芽細胞 / in vitro試験 / 動物実験代償技術 / 安全性試験
研究実績の概要

従来薬剤等の安全性試験には動物が用いられてきた。しかしながら、動物愛護の立場からできるだけ動物を用いない安全性試験の実施が進められている。その中で最も有用性が高いのが、培養細胞を用いたin vitro試験である。その一方で、評価には細胞の調製や播種といった煩雑な操作が必要であり、実施可能な施設は限られていた。本研究の目的は、新たな細胞培養技術であるスフィア培養に着目し、この技術を用いて凍結保存可能なin vitro試験用のプレートを開発することである。はじめに、細胞源としてNIH-3T3細胞およびマウス由来線維芽細胞を用いて、スフィア形成条件の検討を行った。スフィア形成には、回転培養およびスフィア形成専用プレートの両方を比較したが、いずれにおいても効率的にスフィア形成が可能であった。また、形成されるスフィアの大きさは細胞数に依存した。回転培養では、適切な回転速度と濃度を維持することが重要であった。1つのスフィアを各プレートに1つずつ播種し、凍結保護剤を用いてプレート上で凍結した。解凍後の細胞の生存および増殖率について検討を行った。コントロールとして、プレート上で培養した細胞をそのまま凍結した群と、単離してペレットとした通常の培養細胞の凍結条件を使用した。通常のペレットによる凍結条件では、解凍24時間後で95%以上の生存率が得られた。また、ディッシュ上で培養した細胞については、解凍24時間後の生存率は0%であった。一方スフィアについては、すべてのスフィアにて細胞の増殖を認めた。また、スフィアの大きさが小さい場合には増殖に限界があり、大きい場合には壊死する細胞が多く、安定した凍結保存が困難であった。平成28年度の実験から安定したスフィアによる凍結解凍条件を決定することができた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまで確立してきたスフィア培養技術を用いることで、プレート上で安定して細胞の凍結、解凍が可能であることを示すことができた点が、最も大きな成果と言える。また、通常の細胞を接着培養したプレートでは生存率が0%であったことから、本技術の有用性が示された。スフィアについては細胞カウントができないために生存率は確認できないが、すべてのスフィアから安定して細胞増殖が得られたことから、in vitro試験システムとして使用可能と考えられた。

今後の研究の推進方策

今後の課題としては、スフィアをプレートに固定する方法である。すべてのスフィアで凍結、解凍後の生存が得られたが、スフィアは凍結あるいは解凍後にプレート内で移動したため培養細胞の分布には偏りがあり、そのままの条件では評価が困難となる可能性がある。また、解凍後ただちに評価するためには、使用する凍結保護剤の量を最小限とする必要があり、この点についても今後の検討が必要である。しかしながら、実験に必要な環境は整っており、これまでの研究も順調に推移していることから、研究期間内に実験を終了することは可能と考えている。

次年度使用額が生じた理由

これまでに講座で使用していた血清を用いたため、その費用が不要となった。また、細胞の凍結保存に用いるプレートを小さいものにしたため、効率的に実験を行うことが可能となったため。

次年度使用額の使用計画

次年度はスフィアの固定技術を確立する必要があるが、類似の研究もこれまでにはあまり行われておらず、どの程度の実験が必要となるか予測困難である。したがって、次年度に持ち越された研究費については、固定条件の確立のために必要となるものと考えている。また、実際に使用可能なin vitro試験システムとするためには、さまざまな細胞についても同様の方法が可能かどうかを検討する必要がある。もし次年度繰り越した金額に余裕があれば、その他の細胞にも対象を広げて検討を行う予定である。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (6件) (うち国際共著 1件、 査読あり 6件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 2件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Potential application of tissue engineering for the reconstruction of facial bones.2017

    • 著者名/発表者名
      Kagami H.
    • 雑誌名

      Oral Dis.

      巻: 23 ページ: 689-691

    • DOI

      10.1111/odi.12581.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Discontinuation of simvastatin lead to a rebound phenomenon and result in immediate peri-implant bone loss.2016

    • 著者名/発表者名
      Li X, Wu F, Zhang Y, Yang J, Shinohara A, Kagami H.
    • 雑誌名

      Clinical and Experimental Dental Research.

      巻: 2 ページ: 65-72

    • DOI

      10.1002/cre2.23.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Effect of cell seeding conditions on the efficiency of in vivo bone formation.2016

    • 著者名/発表者名
      Hori A, Agata H, Takaoka M, Tojo A, Kagami H.
    • 雑誌名

      Int J Oral Maxillofac Implants.

      巻: 31 ページ: 232-239

    • DOI

      10.11607/jomi.4729.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 根管重鎮剤の逸脱に起因した上顎洞炎の1症例2016

    • 著者名/発表者名
      小林明人、田口明、篠原淳、各務秀明
    • 雑誌名

      松本歯学

      巻: 42 ページ: 25-31

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 上顎洞に広範囲に進展したKeratocystic Odontogenic Tumorの1例2016

    • 著者名/発表者名
      山田真一郎、内田啓一、高田匡基、嶋田勝光、落合隆永、杉野紀幸、長谷川博雅、各務秀明、田口明
    • 雑誌名

      松本歯学

      巻: 42 ページ: 111-117

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 左側頬部に発生した筋肉内脂肪腫の1例2016

    • 著者名/発表者名
      内田啓一、落合隆永、斉藤安奈、杉野紀幸、中野敬介、長谷川博雅、芳澤享子、各務秀明、田口明
    • 雑誌名

      松本歯学

      巻: 42 ページ: 104-110

    • 査読あり
  • [学会発表] Somatic stem cells and their application for bone tissue engineering .2016

    • 著者名/発表者名
      Kagami H.
    • 学会等名
      Tenth People’s Hospital Tongji University Invited Lecture.
    • 発表場所
      Shanghai (China)
    • 年月日
      2016-12-02 – 2016-12-02
    • 招待講演
  • [学会発表] T2緩和差を利用した31P-NMRによる非侵襲的な新生骨量・骨量測定法の開発2016

    • 著者名/発表者名
      斉藤安奈、八上公利、高田匡基、井上 実、 森こず恵、 李 憲起、田口 明、各務秀明、芳澤享子 、篠原 淳
    • 学会等名
      第61回(公社)日本口腔外科学会 総会・学術大会
    • 発表場所
      幕張メッセ(千葉県千葉市)
    • 年月日
      2016-11-25 – 2016-11-27
  • [学会発表] 骨再生治療:基礎研究から臨床応用まで骨髄間質細胞を用いた骨再生治療2016

    • 著者名/発表者名
      各務秀明, 井上実, 朝比奈泉, 宇田川信之.
    • 学会等名
      第23回歯科医学会総会 シンポジウム
    • 発表場所
      福岡国際会議場(福岡県福岡市)
    • 年月日
      2016-10-21 – 2016-10-23
    • 招待講演
  • [図書] 末長書店2016

    • 著者名/発表者名
      各務秀明、井上実、長谷川博雅(山根源之他編)
    • 総ページ数
      640
    • 出版者
      口腔内科学

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公開日: 2018-12-17  

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