| 研究課題/領域番号 |
16K15837
|
|---|
| 研究機関 | 岡山大学 |
|---|
研究代表者 |
上岡 寛 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (80253219)
|
|---|
| 研究分担者 |
坂元 尚哉 首都大学東京, システムデザイン研究科, 准教授 (20361115)
早野 暁 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (20633712)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | 細胞極性 / 骨形成 |
|---|
| 研究実績の概要 |
①siRNAを用いたNeprin-1ノックダウン実験
骨芽細胞様細胞株Saos2細胞に対して、Nesprin-1遺伝子のsiRNAを遺伝子導入することで、細胞骨格アクチンと細胞核との結合を切断し、細胞極性を失わせる。遺伝子導入後、３日経過した時点で細胞固定およびタンパク回収を行い、Nesprin-1に対する蛍光免疫染色およびウエスタンブロッティング法によりノックダウンの効果を確認した。その結果、タンパクレベルでの抑制は確認できた。また、同時におこなったアクチン線維の蛍光染色により、Si-Nesprin群においては、線維の形成が弱いことが確認された。しかしながら、細胞の輪郭においては変化がみられなかった。
②細胞伸展装置を用いたノックダウン細胞の培養実験
骨芽細胞の細胞極性が、凹凸表面構造の認識に重要であることを検討するため、上記実験で作製したノックダウン細胞を、坂元先生の研究室にて、ストレッチ(伸展力)を掛けて、細胞の配行性を確認した。しかしながら、従来坂元教室で、上皮細胞では確認されている伸展方向と直交方向に配列を示すはずの、コントロール細胞では、従来予想されていた細胞の配行性の変化が観察されないことがわかった。よって、ノックダウン細胞との配行性の違いを検討する予定であったが、取りかかりの研究においては、細胞の選択といった最初のステージからの見直しが必要となった。株化の影響も考えられるので、市販されているヒト正常骨細胞を用いた実験を組み立てる予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究実績に述べているように、従来細胞伸展力に対して、直交して再配列を示すと予想されていた株化骨芽細胞に予想された形態変化がみられないことが確認されたために、si-Nesprinの抑制効果を検討することが困難であった。用意しているSi-Nesprinは、ヒトのものであるために、ヒト由来骨芽細胞をあらたに対象とした実験を組み立てなければならなくなったために、従来の予定よりやや遅れている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今回の機械的刺激に対する応答の少なさは株化細胞の問題であることが予想されたので、ヒト骨芽細胞をTakaraより購入して、先のSaos-2細胞で行った同様の実験を行う。すなわち、伸展力の負荷、Si-Nesprinの導入、ウエスタンブロッティングによるタンパク抑制の確認を行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
予定としていた抗体の仕入れが安価ですんだため。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
来年度の消耗品の購入で調整できるために特別な計画は必要ない。
|
