| 研究課題/領域番号 |
16K16195
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
佐々 彰 千葉大学, 大学院理学研究科, 特任助教 (10738347)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゲノム / DNA損傷 / リボヌクレオチド / DNA修復 / 酵素 / 突然変異 |
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| 研究実績の概要 |
ATPやGTPなどの高エネルギーリン酸化合物（リボヌクレオチド、NTP）は、エネルギー産生の基質やRNA前駆体として必須である一方で、DNA複製中にDNA前駆体と間違われてゲノムに取り込まれることがある。さらにNTPの代表的な損傷体である8-oxo-GTPのDNAへの取り込みはゲノムを崩壊させ、重篤な疾患の引き金になり得る。本研究の目的は、NTPがDNAに取り込まれた際の突然変異誘発機構、及び修復メカニズムを明らかにすることである。
本研究計画では、次の3点に着目して実験を進める。①DNAに取り込まれたGTPや8-oxo-GTP、すなわちDNA中のリボグアノシン（rG）及び8オキソリボグアノシン（8-oxo-rG）が引き起こすDNA複製エラー、②rG及び8-oxo-rGの修復機構、③ヒト細胞内でのrG及び8-oxo-rGの突然変異誘発能。
本年度は、上記計画の①について、rGまたは8-oxo-rGを含むDNAを鋳型とした場合の、ヒトDNAポリメラーゼ（Pol）であるPol α、Pol κ及びPol ηによるDNA合成反応を解析した。その結果、Pol αは鋳型上のrGを効率よく乗り越えてDNA合成を行ったが、Pol αのDNA合成活性は8-oxo-rGによって強く阻害された。Pol κは、rG及び8-oxo-rGの手前で強くDNA合成を停止した。一方、Polηはどちらのリボヌクレオチドも非常に効率よく乗り越えてDNAの合成を行った。8-oxo-rGを乗り越える際に、Pol αは8-oxo-rGの向かい側に誤ったヌクレオチドであるdAMPを取り込んだのに対して、Pol κ及びPol ηは正しいヌクレオチドであるdCMPを取り込む傾向にあった。このことから、特にPol ηは8-oxo-rGを効率よく、かつ複製エラーを起こすことなく乗り越えてDNA合成を行うことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ほぼ計画通りに、in vitroにおけるDNA中のrG及び8-oxo-rGが引き起こすDNA複製エラーについて解析を行うことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
精製したDNA修復タンパク質を用いて、in vitroにおけるDNA中のrG及び8-oxo-rGの修復メカニズムの解析を行う。また、細胞内におけるリボヌクレオチドの突然変異誘発能及び修復機構の解析を行うために、ヒトBリンパ芽球細胞において、CRISPR/Cas9システムを用いてリボヌクレオチドの修復に関与すると予想される遺伝子のノックアウトを試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた国際学会への参加を見送ったことで、残額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
酵素活性測定のための生化学実験試薬、及び細胞培養関連試薬の購入に使用する。また、本研究の推進において新たな知見を得るために、国内及び国際会議に参加する。
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